Процесс индукции от hPSCs к клеткам сетчатки сложен и отнимает много времени. Этот оптимизированный протокол может генерировать ткани сетчатки с высокой воспроизводимостью и без затрат. Преимуществом этого протокола является количественная оценка размера EB и плотности покрытия для значительного повышения эффективности и повторяемости индукции сетчатки от hPSCs.
При этом методе все основные клетки сетчатки последовательно появляются и повторяют основные этапы развития сетчатки. Это облегчит моделирование заболеваний и клеточную терапию дегенеративных заболеваний сетчатки. Демонстрируя процедуру, мы с Yuanyuan Guan, аспирантом, и Bingbing Xie, техником из лаборатории.
Начните с приготовления 50 мл раствора ECM, добавив 1 мл третьего 50-кратного запасного раствора к 50 мл DMEM. Затем добавьте 1 мл этого приготовленного раствора ECM в каждую скважину шестилунной пластины и инкубируют его в течение одного часа при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе. Подготовьте поддерживающую среду hPSC в соответствии с инструкцией производителя и предварительно прогрейте ее до комнатной температуры в течение 30 минут.
Налейте криогенный флакон с гПСК из резервуара с жидким азотом, инкубируя его на водяной бане при 37 градусах Цельсия в течение 30 секунд. Тщательно продезинфицируйте его, используя 75% спиртовой спрей и поместите его в шкаф биобезопасности. Перенесите клеточную суспензию из флакона в 15-миллиметровую трубку.
Затем добавьте 5 мл предварительно нагретой поддерживающей среды капля за каплей в трубку с помощью пипетки 5 мл, осторожно встряхивая трубку, чтобы смешать гПСК. Центрифугировать трубку в 170 раз G в течение пяти минут. Осторожно удалите большую часть супернатанта, используя пипетку 1 мл, оставив после себя около 50 микролитров супернатанта, чтобы избежать потери клеток.
Повторно приостановить гранулу с 1 мл поддерживающей среды путем пипетки вверх и вниз. Удалите ECM из предварительно покрытых колодцев и добавьте 1,5 миллилитра поддерживающей среды в каждую скважину. Затем распределите по 0,5 миллилитра клеточной суспензии в каждую лунку.
Аккуратно встряхните пластину, чтобы равномерно распределить гПСК. Поместите пластину в инкубатор при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение не менее 24 часов, чтобы способствовать приверженности клеток. Меняйте среду каждый день и проходите гПСК при 80% слиянии.
На 0-й день инициируйте дифференцировку, удаляя 80%-ные клетки слияния из одной скважины шестилуночной пластины. Соберите клетки с раствором диссоциации ЭДТА, как описано в текстовой рукописи. Удалите раствор ЭДТА и добавьте 1 мл поддерживающей среды, содержащей 10 микромолялярного флувастатина, чтобы остановить диссоциацию клеток.
Соберите клетки с помощью пипетки 1 мл. Переложите клеточную суспензию на 100-миллиметровую сверхнизкую прикрепленную чашку Петри и добавьте в чашку 9 мл поддерживающей среды, содержащей 10 микромолялярных флувастатина. Аккуратно встряхните блюдо дважды, чтобы равномерно распределить клетки.
Затем поместите его в инкубатор при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. После того, как клетки культивируются в течение не менее 24 часов, наблюдайте за ними под микроскопом. Добавьте 9 мл поддерживающей среды и 3 мл NIM в трубку 15 мл.
Переложите клеточные культуры в центрифужную трубку 15 мл и добавьте в чашку 10 мл предварительно разогретой смеси NIM. Центрифугируйте трубку в 60 раз G в течение 3 минут, чтобы собрать агрегаты. Затем удалите супернатант с помощью пипетки 5 мл, оставив после себя примерно 500 микролитров, чтобы избежать потери клеток.
Добавьте 2 мл смеси в пробирку и переложите суспензию обратно в ту же чашку Петри. Аккуратно встряхните блюдо, чтобы равномерно распределить клеточные агрегаты. Затем поставьте блюдо обратно в инкубатор.
На 5-й день удалите ECM из предварительно покрытой посуды и добавьте 10 мл предварительно разогретого NIM к каждому блюду. Доньте блюдо, содержащее Ebs, и проверьте качество ЭБ под микроскопом, убедившись, что они яркие и круглые. Соберите все ЭБ в пробирку 15 мл и дайте им отжиться в течение 5 минут.
Затем удалите большую часть супернатанта, оставив после себя около 2 мл среды. После подсчета ЭБ посыпьте их по каплям с плотностью примерно 2-3 ЭБ на квадратный сантиметр в покрытые оболочкой блюда, содержащие 10 мл NIM. Аккуратно встряхните посуду, равномерно распределите ЭБ и поместите их в инкубатор не менее чем на 24 часа.
Используйте вольфрамовую иглу или иглу со шприцем 1 мл для механического отсоединения морфологически идентифицируемых зрительных везикул вместе с соседним пигментным эпителием сетчатки на 28-35 день. Культививику их в подвезии. Поместите 50-60 зрительных везикул в каждую 100-миллиметровую чашку для культивации с низким прикреплением, содержащую 15 мл РДМ для образования органоидов сетчатки.
Меняйте среду каждые 2-3 дня до 42-го дня. Чтобы инициировать дифференциацию сетчатки, hPSC были диссоциированы на небольшие сгустки и культивированы в суспензии, которая образовывала ЭБ с 1-го дня. На 5-й день ЭБ были нанесены на посуду для культуры, покрытую ECM, и клетки постепенно мигрировали из ЭБ.
На 16-й день индукционная среда была заменена RDM, в результате чего нейронные домены сетчатки формировались и постепенно выступали из чашки, а также клеточно-образующие оптические езиклеподобные структуры, окруженные клетками RPE. В течение дней с 28 по 35 органоиды сетчатки, состоящие из нервной сетчатки, прикреплены к сфере RPE. С одной стороны образовались клетки.
По мере того, как дифференциация и спецификация сетчатки прогрессировали, hPSCs производили подтипы нейронной сетчатки, которые постепенно выстраивались в слои, имитируя архитектурные особенности нативной сетчатки человека. Ганглиоциты сетчатки были впервые получены из прародителей сетчатки и накоплены на базальной стороне нервной сетчатки. С помощью этого протокола органоиды сетчатки развились в высокозрелые фоторецепторы с богатыми палочками и колбочками.
Фоторецепторные клетки были расположены в апикальной стороне, в то время как амакриновые клетки, горизонтальные клетки, биполярные клетки и глиальные клетки Мюллера были расположены в промежуточном слое нервной сетчатки. Ключевыми моментами этого протокола являются создание высокого качества Ebs и засев их при правильной плотности.
