عملية التعريفي من hPSCs إلى خلايا الشبكية معقدة وتستغرق وقتا طويلا. هذا البروتوكول الأمثل يمكن أن تولد أنسجة الشبكية مع استنساخ عالية وبدون تكلفة. ميزة هذا البروتوكول هو تحديد حجم EB وكثافة الطلاء لتعزيز كفاءة وتكرار تحريض الشبكية بشكل كبير من hPSCs.
مع هذه الطريقة، تظهر جميع خلايا الشبكية الرئيسية بشكل تسلسلي وتلخص الخطوات الرئيسية لتطور الشبكية. وسوف يسهل نمذجة الأمراض والعلاج بالخلايا للأمراض التنكسية الشبكية. إثبات الإجراء، ونحن مع يوانيوان غوان، وهو طالب دكتوراه، وبينغبينغ شيه، وهو فني من المختبر.
ابدأ بإعداد 50 مل من حلول ECM بإضافة 1 مل من حل المخزون 50 مرة الثالث إلى 50 مل من DMEM. ثم، إضافة 1 مل من هذا الحل ECM أعدت لكل بئر من لوحة من ستة آبار واحتضانه لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. إعداد hPSC صيانة المتوسطة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وprewarm إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
صب قارورة المبردة من hPSCs من خزان النيتروجين السائل عن طريق احتضانه في حمام مائي في 37 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. تطهير بعناية باستخدام رذاذ الكحول 75٪، ووضعها في خزانة السلامة الحيوية. نقل تعليق الخلية من القارورة إلى أنبوب 15 ملليمتر.
ثم، إضافة 5 مل من الصيانة قبل الحارة المتوسطة قطرة قطرة إلى الأنبوب باستخدام ماصة 5 مل، في حين يهز بلطف أنبوب لمزج hPSCs. طرد مركزي الأنبوب في 170 مرة G لمدة خمس دقائق. إزالة بعناية معظم supernatant باستخدام ماصة 1 مل، تاركا وراءه ما يقرب من 50 ميكرولتر من supernatant لتجنب فقدان الخلايا.
إعادة تعليق بيليه مع 1 مل من الصيانة المتوسطة عن طريق pipetting صعودا وهبوطا. إزالة ECM من الآبار المغلفة مسبقا وإضافة 1.5 ملليلتر من الصيانة المتوسطة إلى كل بئر. ثم توزيع 0.5 ملليلتر من تعليق الخلية في كل بئر.
يهز بلطف لوحة لتوزيع hPSCs بشكل موحد. ضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة على الأقل لتعزيز الالتزام بالخلايا. تغيير المتوسطة كل يوم ومرور hPSCs في التقاء 80٪.
في اليوم-0، ابدأ التمايز عن طريق إزالة خلايا الالتقاء بنسبة 80٪ من بئر واحد من لوحة الستة آبار. جمع الخلايا مع حل ينفصم EDTA كما هو موضح في المخطوطة النصية. إزالة الحل EDTA وإضافة 1 مل من صيانة المتوسطة التي تحتوي على 10 فلوفاستاتين ميكرومولار لوقف تفكك الخلايا.
جمع الخلايا مع ماصة 1 مل. نقل تعليق الخلية إلى 100 ملليمتر فائقة منخفضة تعلق طبق بيتري وإضافة 9 مل من متوسط الصيانة التي تحتوي على 10 فلوفاستاتين ميكرومولار إلى الطبق. يهز الطبق برفق مرتين لتوزيع الخلايا بشكل موحد.
ثم ضعها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة على الأقل ، لاحظها تحت المجهر. أضف 9 مل من متوسط الصيانة و3 مل من NIM إلى أنبوب 15 مل.
نقل ثقافات الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل وإضافة 10 مل من خليط NIM قبل الحارة إلى الطبق. طرد مركزي الأنبوب في 60 مرة G لمدة 3 دقائق لجمع المجاميع. ثم إزالة supernatant باستخدام ماصة 5 مل، تاركا وراءه ما يقرب من 500 ميكرولتر لتجنب فقدان الخلايا.
أضف 2 مل من الخليط إلى الأنبوب ونقل التعليق مرة أخرى إلى نفس طبق بيتري. يهز الطبق برفق لتوزيع مجاميع الخلية بشكل موحد. ثم، وضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة.
في اليوم الخامس، قم بإزالة ECM من الأطباق المغلفة مسبقا وأضف 10 مل من NIM التي تم تسخينها مسبقا إلى كل طبق. أخرج الطبق الذي يحتوي على Ebs وتحقق من جودة EBs تحت المجهر ، مع التأكد من أنها مشرقة ومستديرة. جمع جميع EBs في أنبوب 15 مل والسماح لهم لتسوية لمدة 5 دقائق.
ثم، وإزالة معظم supernatant، تاركا وراءه حوالي 2 مل من المتوسطة. بعد عد EBs، البذور لهم قطرة ب قطرة في كثافة ما يقرب من 2-3 EBs لكل سنتيمتر مربع في أطباق مغلفة تحتوي على 10 مل من NIM. هز الأطباق برفق لتوزيع EBs بشكل موحد ووضعها في الحاضنة لمدة 24 ساعة على الأقل.
استخدم إبرة التنغستن أو إبرة مع حقنة 1 مل لفصل الحويصلات البصرية التي يمكن التعرف عليها شكليا ميكانيكيا، جنبا إلى جنب مع ظهارة صبغة الشبكية المجاورة في الأيام من 28 إلى 35. ثقافة لهم في التعليق. وضع 50-60 الحويصلات البصرية في كل طبق ثقافة مرفق منخفض 100 ملليمتر، تحتوي على 15 مل من RDM لتشكيل الجهاز الشبكية.
تغيير المتوسطة كل 2 إلى 3 أيام حتى يوم-42. ولبدء التمايز الشبكي، تم فصل مركبات hPSCs إلى كتل صغيرة وزرعت في التعليق، والتي شكلت EBs منذ اليوم الأول. في اليوم -5 كانت مطلية EBs على أطباق الثقافة المغلفة ب ECM وهاجرت الخلايا تدريجيا من EBs.
في اليوم -16 ، تم استبدال وسيط التعريفي RDM ، مما تسبب في تشكيل نطاقات شبكية العين العصبية وتبرز تدريجيا من الطبق ، وكذلك ، تشكيل خلايا تشبه الحويكل البصري محاطة بخلايا RPE. خلال أيام-28 إلى 35، الأجهزة العضوية الشبكية تتكون من شبكية العين العصبية، تعلق على كرة RPE. في جانب واحد، تشكلت الخلايا.
ومع تقدم تمايز الشبكية ومواصفاتها، أنتجت hPSCs أنواعا فرعية من شبكية العين العصبية التي اصطفت تدريجيا في طبقات، تحاكي السمات المعمارية لشبكية العين البشرية الأصلية. تم توليد خلايا العقدة الشبكية لأول مرة من السلف الشبكية وتراكمت في الجانب القاعدي من شبكية العين العصبية. مع هذا البروتوكول، تطورت organoids الشبكية إلى مستقبلات ضوئية ناضجة للغاية مع كل من قضبان غنية والمخاريط.
وتقع خلايا المستقبلات الضوئية في الجانب apical، في حين أن خلايا الأماغرين والخلايا الأفقية والخلايا ثنائية القطب والخلايا الدبقية مولر كانت كلها تقع في الطبقة المتوسطة من شبكية العين العصبية. النقاط الرئيسية لهذا البروتوكول هي خلق جودة عالية من Ebs وبذر لهم في الكثافة المناسبة.
