Этот протокол очень важен, поскольку он представляет собой современный рабочий процесс для глобального анализа метилирования аргинина белка с помощью масс-спектрометрии. Это единственный метод идентификации и профилирования R-метилированного белка с единым разрешением стиля, которое недостижимо с помощью других биохимических методов. В сочетании с использованием ингибиторов PRMT, некоторые из которых находятся в клинических испытаниях и противораковых препаратах, этот протокол позволяет провести углубленный анализ механизма их действия.
Для начала выполните восстановление тиольной группы белков с помощью запасного раствора ДТТ, растворенного в сверхчистой воде в конечной концентрации 4,5 миллимоляра, и оставьте реакцию на 30 минут при 55 градусах Цельсия. Выполняют алкилирование тиольной группы белков путем добавления йодоацетамида в концентрации 10 миллимоляров и инкубации в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Чтобы проверить эффективность протеолиза, сохраните аликвоту белкового экстракта для последующего анализа на геле, окрашенном SDS-PAGE Coomassie, и сравните его с соответствующим количеством образца при пищеварении.
Разбавьте оставшийся белковый экстракт четырьмя объемами 20 миллимоляров HEPES при рН 8,0, чтобы достичь конечной концентрации мочевины в два моляра. Разделите образец на две части, затем добавьте модифицированный трипсин секвенирования к одной и протеазу ЛизаргиНазы к другой. Оставьте образцы на ночь при температуре 37 градусов цельсия в термомиксоре со скоростью 600 оборотов в минуту, чтобы обеспечить ферментативное пищеварение.
Для каждого хроматографического градиента соберите все фракции в глубокую 96-луночную пластину. Объедините дроби, собранные до начала градиента, в одну единственную дробь, названную pre. Объедините 60 фракций из хроматографического градиента жидкости с высокой рН, объединив их несмежным образом в 14 конечных фракций.
Чтобы получить несмежную конкатенацию, объедините фракции обратной фазы с высоким рН, как описано в текстовой рукописи. Объедините дроби, собранные после градиента, в уникальную дробь с именем post. Выполняют последовательное иммуноаффинное обогащение модифицированного пептида отдельно для двух образцов из диверсий трипсина и лисаргиназы.
Разбавьте 10-кратную концентрированную иммуноаффинную очистку или буфер IAP в 10 раз. Центрифугируйте лиофилизированные пептиды при 2000 г в течение пяти минут, чтобы раскрутить пептиды до дна трубки. Повторно суспендируют пептиды 250 микролитрами разбавленного буфера IAP на 15-миллилитровую трубку и перекладывают в 1,5-миллилитрную низкосвязывающую трубку.
Используйте лакмусовую бумагу, чтобы проверить, что рН больше шести. Сохраните небольшую аликвоту каждой дроби в качестве входных данных для последующего анализа MS. Разделите каждую фракцию на две части, чтобы выполнить иммунообогащение асимметрично диметилированными, или ADMA, и симметрично диметилированными, или SDMA, пептидами параллельно.
Готовят три флакона с выбранными антипан-R-метилированными антителами, конъюгированными с белком А агарозовыми шариками на 10 миллиграммов исходного белкового экстракта. Подготовьте правильное количество антител, конъюгированных с шариками агарозы, центрифугируя каждый флакон при 2000 г в течение 30 секунд и удаляя буфер из шариков. Вымойте бусины три раза одним миллилитром 1X PBS, центрифугируя их при 2000 G в течение 30 секунд.
После последней стирки повторно суспендируйте бусины по 40 микролитров по 1X PBS для каждого флакона, объедините их и затем, наконец, разделите поровну на 16 фракций. Добавьте 250 микролитров буфера 1X IAP в каждую трубку и перемешайте путем инвертирования. Затем высиживают трубки на вращающемся колесе в течение двух часов при четырех градусах Цельсия.
После инкубации центрифугируют 1,5-миллилитровые трубки, содержащие пептиды и пан-R-метиловые антитела, конъюгированные шарики по 2000 г в течение 30 секунд, чтобы гранулировать шарики и перенести прохождение из каждой фракции в чистую 1,5-миллилитрную низкосвязывающую трубку. Добавьте шарики к проточному сопряжению с антителами против R-монометилирования и повторите ресуспензию в PBS, инкубацию с буфером IAP и центрифугирование. Во время инкубации пептидных образцов с монометилизацией или ШАРИКАМИ ММА дважды промывайте фракции, которые ранее были иммунопреципитированы анти-ADMA и SDMA с буфером IAP 250 микролитров и выбрасывайте супернатант после каждой промывки.
Затем трижды промыть водой класса LC-MS. Элюируют аффинные обогащенные пептиды SDMA или ADMA из шариков агарозы путем добавления 50 микролитров 0,15 TFA в каждую трубку. Оставьте этот раствор на 10 минут при комнатной температуре, переворачивая трубки каждые две-три минуты.
Переложите первое элюирование в чистые 1,5-миллилитровые низкосвязывающие трубки и повторите элюирование с 50 микролитрами 0,15 TFA. Сложите две фракции элюирования в одну трубку. Повторите этот процесс для R-монометилированных пептидов, которые были инкубированы с шариками анти-ММА антител.
После смешивания легких и тяжелых меченых клеток белки экстрагировали и подвергали перевариванию трипсином и лисаргиназой. Гель, окрашенный SDS-PAGE Coomassie, использовался для проверки эффективного ферментативного переваривания общих белков в пептидах. Оценивали эффективность стадии очистки, выполненной колонкой C18 Sep-Pak, подтверждая отсутствие пептидов в протекании колонны C18 и в первой и второй промывке, а также их ожидаемое присутствие в элюенте.
Оценивалось правильное включение MET4 в тяжелый канал и правильное тяжелое или легкое смешивание. Здесь показана хроматограмма из автономной референтной фазы жидкой хроматографии с высоким рН фракционирования пептидов и последующей несмежной конкатенации фракций. Пептиды были обнаружены 250-нанометровым УФ-излучением, в то время как потенциально оставшиеся непереваренные белки были оценены 280-нанометровым УФ-излучением. Получены полные спектры MS пептидов, представляющих истинно положительную аннотацию метилпептида.
Различия между M и Z, наблюдаемые между тремя пиками, согласуются с наличием ферментативно метилированного остатка. Получены полные спектры MS пептидов, представляющих ложноположительную аннотацию метилпептида. Различия между легким метилированным пептидом и его карательным тяжелым аналогом отклоняются от ожидаемого значения на 0,0312.
Рабочий процесс протокола в целом линейный, но есть несколько шагов, которые требуют особого внимания. Например, разделение хроматографии IPH с несмежной фракционной конкатенацией, а также настройка IP. Этот же протокол может быть соединен либо со стандартным SILAC, либо с количественным определением без маркировки для профилирования динамики метилирования аргинина в ответ на различные возмущения.
Этот протокол прокладывает путь к характеристике степени и динамики метилирования белка в нескольких типах клеток и модельных системах, поддерживающих все аспекты фундаментальных и трансляционных исследований, ориентированных на PRMT.
