Dieses Protokoll ist von großer Bedeutung, da es den hochmodernen Workflow für die globale Analyse der Proteinargininmethylierung durch Massenspektrometrie darstellt. Dies ist die einzige Methode, um R-methyliertes Protein mit einer einzigen Stilauflösung zu identifizieren und zu profilieren, die mit anderen biochemischen Techniken nicht erreichbar ist. In Verbindung mit der Verwendung von PRMT-Inhibitoren, von denen sich einige in klinischen Studien und Krebsmedikamenten befinden, ermöglicht dieses Protokoll eine eingehende Analyse ihres Wirkmechanismus.
Führen Sie zunächst eine Reduktion der Thiolgruppe von Proteinen mit einer Stammlösung von DTT durch, die in Reinstwasser in einer Endkonzentration von 4,5 Millimol gelöst ist, und lassen Sie die Reaktion 30 Minuten bei 55 Grad Celsius laufen. Die Alkylierung der Thiolgruppe von Proteinen wird durch Zugabe von Iodacetamid in einer Konzentration von 10 Millimol durchgeführt und 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Um die Proteolyseeffizienz zu überprüfen, speichern Sie ein Aliquot Proteinextrakt für die anschließende Analyse auf SDS-PAGE Coomassie-gefärbtem Gel und vergleichen Sie es mit einer entsprechenden Probenmenge beim Aufschluss.
Verdünnen Sie den verbleibenden Proteinextrakt mit vier Volumen von 20 Millimolar HEPES bei pH 8,0, um eine endgültige Harnstoffkonzentration von zwei Molaren zu erreichen. Teilen Sie die Probe in zwei Teile auf und fügen Sie dann sequenziertes Trypsin zu einem und LysargiNase-Protease zu dem anderen hinzu. Lassen Sie die Proben über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem ThermoMixer bei 600 Umdrehungen pro Minute, um einen enzymatischen Aufschluss zu ermöglichen.
Sammeln Sie für jeden chromatographischen Gradienten alle Fraktionen in einer tiefen 96-Well-Platte. Fassen Sie die vor Beginn des Farbverlaufs gesammelten Brüche zu einem einzigen Bruch mit dem Namen pre zusammen. Verketten Sie die 60 Fraktionen aus dem Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographischen Gradienten mit hohem pH-Wert, indem Sie sie auf nicht zusammenhängende Weise zu 14 Endfraktionen zusammenfassen.
Um eine nicht zusammenhängende Verkettung zu erhalten, poolen Sie die umgekehrten Phasenfraktionen mit hohem pH-Wert, wie im Textmanuskript beschrieben. Fassen Sie die nach dem Farbverlauf gesammelten Brüche zu einem eindeutigen Bruch mit dem Namen post zusammen. Führen Sie eine sequentielle Immunaffinitätsanreicherung des modifizierten Peptids separat für die beiden Proben aus Trypsin- und LysargiNase-Verdauungen durch.
Verdünnen Sie die 10-fache konzentrierte Immunaffinitätsreinigung oder den IAP-Puffer 10-mal. Zentrifugieren Sie die lyophilisierten Peptide bei 2.000 G für fünf Minuten, um die Peptide auf den Boden des Röhrchens zu schleudern. Die Peptide werden mit 250 Mikrolitern verdünntem IAP-Puffer pro 15-Milliliter-Röhrchen resuspendiert und in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit niedriger Bindung überführt.
Verwenden Sie ein Lackmuspapier, um zu überprüfen, ob der pH-Wert größer als sechs ist. Bewahren Sie ein kleines Aliquot jeder Fraktion als Eingabe für die nachfolgende MS-Analyse auf. Teilen Sie jede Fraktion in zwei Teile, um die Immunanreicherung von asymmetrisch dimethylierten oder ADMA- und symmetrisch dimethylierten oder SDMA-Peptiden parallel durchzuführen.
Bereiten Sie drei Durchstechflaschen mit den ausgewählten Anti-Pan-R-methylierten Antikörpern vor, die an Protein-A-Agaroseperlen pro 10 Milligramm des ursprünglichen Proteinextrakts konjugiert sind. Bereiten Sie die richtige Menge an Antikörpern vor, die an Agaroseperlen konjugiert sind, indem Sie jede Durchstechflasche 30 Sekunden lang bei 2.000 g zentrifugieren und den Puffer aus den Beads entfernen. Waschen Sie die Perlen dreimal mit einem Milliliter 1X PBS, indem Sie sie bei 2.000 G für 30 Sekunden zentrifugieren.
Nach dem letzten Waschgang die Perlen in 40 Mikroliter 1X PBS für jede Durchstechflasche resuspendieren, bündeln und schließlich gleichmäßig in 16 Fraktionen teilen. Fügen Sie 250 Mikroliter 1X IAP-Puffer zu jedem Röhrchen hinzu und mischen Sie durch Invertieren. Anschließend brüten Sie die Röhrchen auf einem rotierenden Rad zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius aus.
Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die 1,5-Milliliter-Röhrchen, die Peptide und pan-R-Methyl-Antikörper-konjugierte Beads enthalten, bei 2.000 G für 30 Sekunden, um die Beads zu pelletieren und den Durchfluss von jeder Fraktion in ein sauberes 1,5-Milliliter-Low-Binde-Röhrchen zu übertragen. Fügen Sie die Kügelchen zu dem mit Antikörpern gegen R-Monomethylierung konjugierten Durchfluss hinzu und wiederholen Sie die Resuspension in PBS, Inkubation mit IAP-Puffer und Zentrifugation. Während der Inkubation der Peptidproben mit Monomethylierungs- oder MMA-Perlen die Fraktionen, die zuvor mit Anti-ADMA und SDMA immunpräzipitiert wurden, zweimal mit 250 Mikroliter IAP-Puffer waschen und den Überstand nach jedem Waschgang verwerfen.
Anschließend dreimal mit LC-MS-Wasser waschen. Eluieren Sie die affinitätsangereicherten SDMA- oder ADMA-Peptide aus den Agarosegelperlen, indem Sie 50 Mikroliter 0,15 TFA zu jedem Röhrchen hinzufügen. Lassen Sie diese Lösung 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen und drehen Sie die Röhrchen alle zwei bis drei Minuten um.
Die erste Elution wird in saubere 1,5-Milliliter-Low-Binding-Röhrchen überführt und die Elution mit 50 Mikrolitern 0,15 TFA wiederholt. Poolen Sie die beiden Elutionfraktionen in einer Röhre. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die R-monomethylierten Peptide, die mit den Anti-MMA-Antikörperperlen inkubiert wurden.
Nach dem Mischen der leicht und schwer markierten Zellen wurden Proteine extrahiert und der Verdauung durch Trypsin und LysargiNase unterzogen. Ein SDS-PAGE Coomassie-gefärbtes Gel wurde verwendet, um die effiziente enzymatische Verdauung von Gesamtproteinen in Peptiden zu überprüfen. Die Effizienz des Reinigungsschritts, der von der C18 Sep-Pak-Säule durchgeführt wurde, wurde bewertet und bestätigte das Fehlen von Peptiden im Durchfluss der C18-Säule und in der ersten und zweiten Wäsche sowie deren erwartete Anwesenheit im Eluenten.
Die richtige MET4-Einarbeitung in den schweren Kanal und die korrekte schwere oder leichte Mischung wurden bewertet. Das Chromatogramm aus der Offline-Flüssigchromatographie mit hohem pH-Wert und der anschließenden nicht zusammenhängenden Verkettung von Fraktionen wird hier gezeigt. Peptide wurden durch 250 Nanometer UV detektiert, während potenziell verbleibende unverdaute Proteine durch 280 Nanometer UV bewertet wurden. Die vollständigen MS-Spektren von Peptiden, die eine echte positive Methylpeptidannotation darstellen, wurden erhalten.
Die zwischen den drei Peaks beobachteten M-über-Z-Unterschiede stimmen mit dem Vorhandensein von enzymatisch methylierten Rückständen überein. Die vollständigen MS-Spektren von Peptiden, die eine falsch positive Methylpeptidannotation darstellen, wurden erhalten. Die beobachteten M über Z-Unterschiede zwischen dem leicht methylierten Peptid und seinem strafenden schweren Gegenstück weichen um 0,0312 vom Erwartungswert ab.
Der Protokoll-Workflow ist insgesamt linear, aber es gibt einige Schritte, die besondere Aufmerksamkeit erfordern. Zum Beispiel die IPH-Chromatographie-Trennung mit nicht-zusammenhängender Fraktionsverkettung, sowie der IP-Aufbau. Das gleiche Protokoll kann entweder mit Standard-SILAC oder markierungsfreier Quantifizierung gekoppelt werden, um die Dynamik der Argininmethylierung als Reaktion auf eine Vielzahl von Störungen zu profilieren.
Dieses Protokoll ebnet den Weg zur Charakterisierung des Ausmaßes und der Dynamik der Proteinmethylierung in verschiedenen Zelltypen und Modellsystemen, die alle Aspekte der Grundlagen- und translationalen Forschung mit Schwerpunkt auf PRMTs unterstützen.
