Эта методология обеспечивает функциональный подход для исследований развития сетчатки у цыпленка. Этот метод поддерживает быстрое и стойкое подавление генов-мишеней в определенной области сетчатки. Этот подход может быть применен и к другим частям эмбриона цыпленка, включая как нервные, так и ненервные ткани.
Для электропорации in ovo приготовьте 0,25%-ный раствор Fast Green, растворив 25 миллиграммов Fast Green FCF в 10 миллилитрах PBS, затем отфильтруйте раствор с помощью шприцевого фильтра 0,2 мкм. Затем приготовьте раствор для инъекций коктейля ДНК, смешав изумрудную плазмиду GFP микроРНК с плазмидой экспрессии транспозазы Tol2 в соотношении два к одному. Затем добавьте приготовленный раствор Fast Green в коктейль ДНК в соотношении один к 10 для визуализации области инъекции.
Далее настраивают аппарат для микроинъекций. Аппарат состоит из шприца Гамильтона, двухдюймовой иглы 18-го калибра, двухсантиметровой трубки из поливинилхлорида и иглы для микропипетки. Наполните шприц Hamilton тяжелым минеральным маслом, затем прикрепите иглу 18 калибра к шприцу и заполните внутреннее пространство иглы маслом, нажав на поршень шприца.
Затем прикрепите трубку из поливинилхлорида к концу иглы и наполните трубку маслом. Прикрепите вытянутую иглу микропипетки к трубке. Затем под препарирующим микроскопом с помощью тонких щипцов отломите кончик иглы до диаметра от 10 до 20 микрометров, чтобы сделать небольшое отверстие.
Залейте всю иглу маслом. Затем налейте пять микролитров цветного коктейля ДНК на чашку Петри. Под препарирующим микроскопом поместите кончик иглы микропипетки в раствор ДНК на чашке Петри и медленно втяните раствор в иглу.
После того, как давление внутри и снаружи иглы уравновесится, выньте кончик иглы из раствора ДНК и держите его погруженным в стерильный PBS в небольшом стакане до инъекции. Затем, чтобы настроить электропорационный аппарат, плотно закрепите пару платиновых электродов с электрододержателем на микроманипуляторе. Отрегулируйте расстояние между кончиками электродов до двух миллиметров и подключите электроды к генератору импульсов прямоугольной формы с помощью кабелей.
Далее для микроинъекции ДНК извлеките из инкубатора оплодотворенное яйцо белого леггорна и протрите поверхность яйца папиросной бумагой, смоченной в 70%-ном этаноле. Затем прикрепите иглу 18 калибра к шприцу объемом 10 миллилитров и введите иглу через тупой конец яйца под углом вниз, чтобы не повредить желток. После извлечения двух-трех миллилитров альбумина из яйца заклейте отверстие кусочком скотча и зажгите яйцо свечой, чтобы убедиться, что эмбрион и вителлиновая оболочка отделены от скорлупы.
Далее с помощью щипцов снимают кусочек яичной скорлупы с верхней части яйца, обнажая зародыш. Не выбрасывайте более пяти яйцеклеток одновременно, чтобы предотвратить высыхание эмбрионов во время электропорации. Введите кончик иглы в пузырь зрительного нерва с проксимальной стороны под углом 45 градусов и введите коктейль ДНК, медленно нажимая на поршень, пока раствор синего цвета не заполнит просвет.
Извлеките иглу и поместите ее кончик обратно в PBS. Для электропорации установите напряжение импульса на 15 вольт, длину импульса на 15 миллисекунд, интервал импульса на 915 миллисекунд и номер импульса на пять. После добавления нескольких капель HBSS на вителлиновую мембрану над эмбрионом, с помощью микроманипулятора опустите электроды в HBSS перпендикулярно передне-задней оси эмбриона.
Расположите электроды по обе стороны от пузырька зрительного нерва, убедившись, что электроды не касаются эмбриона или кровеносных сосудов, затем примените импульсные электрические поля. После завершения электропорации снимите электроды и аккуратно очистите электроды стерильной ватной палочкой, смоченной в воде, чтобы избежать накопления альбумина. Заклейте окно скотчем, и инкубируйте эмбрион до желаемой стадии развития.
Трансфекция отдельных последовательностей пре-микроРНК в клетки Nel AP, экспрессирующие HEK293T, приводила к значительному подавлению экспрессии Nel конструкциями против нуклеотидов 482–502, 910–930 и 2461–2481. Сцепление двух последовательностей микроРНК значительно повысило эффективность нокдауна. Все три комбинации показали повышенную супрессивную активность по сравнению с отдельными последовательностями премикроРНК.
Стойкое подавление наблюдалось не менее чем через 13 дней после трансфекции. Когда конструкция пре-микроРНК Nel, нацеленная на нуклеотиды 482–502 и 2461–2481, была трансфицирована вместе с вектором экспрессии транспозазы в сетчатку цыпленка, экспрессия Nel в пигментном эпителии сетчатки была значительно снижена в изумрудных клетках, экспрессирующих GFP, на 4,5-й день эмбриона. У восьмидневных эмбрионов экспрессия Nel также снижалась в ганглиозных клетках сетчатки.
Напротив, на экспрессию Nel в сетчатке не влияло введение контрольной микроРНК. После этой процедуры влияние на подавление генов-мишеней может быть изучено с помощью различных методов, таких как изучение пролиферации и дифференцировки клеток, клеточной гибели, а также отслеживание клеток и аксонов.
