Этот протокол позволяет любому человеку проводить одномолекулярные эксперименты FRET для измерения точных абсолютных расстояний в биомолекулах с помощью smfBox, который является дешевым, надежным инструментом с открытым исходным кодом. smFRET позволяет смотреть на одну молекулу за раз, а не на средние многие миллиарды молекул, чтобы вы могли охарактеризовать различные конформации, которые они принимают. Прелесть этого метода в том, что его можно использовать для пролития света на структуру и динамику многих биомолекулярных систем.
Например, сворачивание белка, белковые взаимодействия ДНК и аллостерия ДНК. Перед началом анализа запустите лазерный центр управления и подтвердите, что выбран режим переменного постоянного тока непрерывной волны. Включите оба лазера.
Запустите программное обеспечение для приобретения smOTTER и убедитесь, что каждый прибор настроен правильно. Чтобы выровнять траекторию излучения, поместите каплю погружного масла на объектив и аккуратно поместите чистое покровное стекло на объектив, опустившись под углом к маслу, чтобы предотвратить захват пузырьков воздуха между защитным стеклом и объективом. Затем добавьте 10 микролитров 100 наномолярного красителя Cy3B на центр покровного стекла.
На панели рабочих циклов лазера установите донорский лазер на ноль выключенных, 45 включенных и 55 выключенных. Установите для акцепторного лазера значение 50 выкл., 45 вкл. и пять выкл. Установите переменное лазерное возбуждение или период ALEX на 100 микросекунд.
Откройте вкладку Z-фокус. На панели сбора переключите лазеры в режим реального времени и запустите камеру. Отрегулируйте экспозицию таким образом, чтобы яркое пятно выглядело в центре в окружении черного фона.
Начиная с низкого положения Z, увеличивайте высоту до тех пор, пока яркое пятно не достигнет своего минимального размера. Затем поднимите высоту до дополнительных 20 микрометров, чтобы сфокусировать лазер в образце над маслом и накрыть стекло. Когда образец попадет в фокус, остановите камеру.
В центре управления omicron уменьшите мощность зеленого лазера при мониторинге шкалы оси Y на вкладке выравнивания smOTTER до тех пор, пока не будет наблюдаться считывание с обоих детекторов, изменяя шкалу по мере необходимости. Затем открутите четыре винта в передней части smfBox, чтобы снять переднюю панель. Чтобы выровнять точечное отверстие, поверните ручку X на позиционере точечного отверстия во время просмотра сигнала на вкладке выравнивания, чтобы увеличить сигнал зеленым и красным цветом.
Поверните ручку Y, чтобы выровнять точечное отверстие в другом направлении, затем вернитесь к ручке X, чтобы проверить дальнейшее увеличение сигнала. Чтобы выровнять объектив с точечным отверстием, поверните ручку X объектива в одном направлении, чтобы уменьшить сигнал, затем поверните ручку pinhole X в том же направлении, чтобы вернуть сигнал на исходный уровень. Если новый максимальный сигнал выше, чем раньше, продолжайте итеративно перемещать ручки точечного отверстия и линзы в этом направлении.
Если сигнал ниже, чем раньше, итеративно переместите ручки в противоположном направлении, затем повторите выравнивание с помощью точечного отверстия и ручек Y объектива. Для выравнивания объектива лавинного фотодиода, начиная с зеленого лавинного фотодиода, перемещайте ручку X до тех пор, пока зеленый сигнал не достигнет максимума. Повторите изменение сигнала для ручки Y.
Вернитесь к ручке X, перемещаясь вперед и назад, чтобы найти пороговые точки, на которые начинает падать сигнал. Оставьте сигнал в положении на полпути между этими двумя точками. Найдите положение на полпути для ручки Y и повторите выравнивание для красного лавинного фотодиода.
Перед анализом первого образца очистите сцену пропитанной метанолом салфеткой для очистки линзы, аккуратно протирая объектив от одного конца до другого и нанесите три-четыре капли погружного масла на центр объектива. Добавьте 10 микролитров сверхчистой воды первого типа в центр чистого покровного стекла и контролируйте след воды, чтобы убедиться, что флуоресцентные сигналы не наблюдаются. Затем используйте резиновый пинцет, чтобы аккуратно снять покровное стекло и при необходимости пополнить масло погружения.
Чтобы обеспечить получение одномолекулярных данных, после разбавления образца выбирают концентрацию, при которой в живой панели трассировки наблюдается от одного до пяти всплесков в секунду. Когда соответствующая концентрация будет определена, прижмите силиконовые изоляторы диаметром от восьми до девяти миллиметров к центру нового покровного стекла и осторожно добавьте 10 микролитров образца в центр, избегая контакта с силиконом. Плотно поместите второе покровное стекло на изоляторы до образования уплотнения.
Проверьте живую стехиометрию по сравнению с гистограммой эффективности FRET, чтобы увидеть, ведет ли образец себя так, как ожидалось. На панели настроек сохранения введите информацию о названии и деталях образца, метках донора и акцептора, длинах волн возбуждения буфера, донора и акцептора, длинах волн обнаружения и мощности лазера, принадлежности к конечному пользователю и пользователю. На панели сбора данных введите продолжительность эксперимента в минутах и выберите соответствующий интервал сохранения, чтобы уменьшить потенциальную потерю данных в случае ошибки.
При необходимости выберите Сохранить мощность лазера, затем нажмите кнопку Пуск, чтобы начать сбор данных. При положительном результате будет получено от пяти до одного всплеска в секунду. При отрицательном результате в течение одного и того же периода времени будет наблюдаться слишком много или слишком мало всплесков.
После сбора и анализа график чередования должен соответствовать периоду ALEX экспериментальной установки. Временной след используется для качественной оценки разумной концентрации образца. Фоновый график показывает распределение межфотонных периодов задержки с линейным соответствием более длительному времени для оценки фоновой скорости.
Фоновая трассировка может быть использована для определения того, были ли изменения в образце в течение всего эксперимента. Генерируются гистограммы эффективности стехиометрии и FRET, отбирающие для всех видов и дважды меченых видов. Гистограмма эффективности 1D FRET генерируется с гауссовской подгонкой данных.
Таким образом, концентрация образца здесь является ключевой. Если он слишком высок, вы больше не проводите эксперимент с одной молекулой, тогда как если он слишком низкий, получение данных займет слишком много времени. Это позволило определить структуры динамических биомолекул, которые не могут быть определены другими методами, такими как ЯМР или кристаллография.
