На сегодняшний день не существует клинически подтвержденной платформы визуализации Т-клеток рецептора химерного антигена. Симпортер натрия-йодида представляет собой чувствительного и клинически значимого репортера для изображения автомобильных Т-клеток с помощью ПЭТ-сканирования. TLP-визуализация Т-клеток NIS CAR позволяет исследователям неинвазивно отслеживать инфузионные клетки in vivo и имеет потенциал для прогнозирования эффективности и токсичности Т-клеточной терапии CAR.
Эффективная визуализация Т-клеток CAR позволяет оценить трафик и расширение Т-клеток и позволяет разрабатывать стратегии для преодоления ограничений. Метод, описанный в этом протоколе, прост и может быть применен к другим конструкциям CAR, помимо тех, которые показаны в этом исследовании. Начинают с выделения мононуклеарных клеток периферической крови или ПБМК из образца крови с использованием метода стандартного градиента плотности.
Для этого осторожно добавьте 15 миллилитров среды градиента плотности в 50-миллилитровую градиентную трубку разделения градиента плотности, избегая образования пузырьков. Чтобы избежать захвата клеток, разбавьте образец крови PBS, содержащим 2% FBS в объемном соотношении один к одному, и осторожно перенесите разбавленную кровь поверх среды градиента плотности, не нарушая границу раздела между ними. Затем центрифугируют разделительную трубку в 1, 200 раз G в течение 10 минут при комнатной температуре.
Соберите супернатант в свежую 50-миллилитровую коническую трубку, промыть клетки PBS, содержащим 2% FBS, заполнив трубку до отметки до 50 миллилитров, и центрифугируя трубку в 300 раз G в течение восьми минут при комнатной температуре. Аспирировать супернатант перед повторным использованием гранулированных клеток в 50 миллилитрах PBS, содержащих 2% FBS. Повторно суспендируют гранулированные МПК в ПБС, содержащие 2%ФБС, до концентрации в 50 раз 10 до шестых клеток на миллилитр.
Повторите стирку в свежем 50-миллилитровом тюбике. Подсчитайте количество клеток, а затем центрифугируйте клеточную суспензию в 300 раз G в течение восьми минут при комнатной температуре. Для изоляции Т-клеток перенесите изолированные НБМК в 14-миллилитровую полистирольную трубку с круглым дном.
Затем используйте набор магнитных шариков отрицательного отбора для выполнения изоляции Т-клеток, помещая PBMCs в коктейль антител отрицательного отбора в полностью автоматизированный клеточный сепаратор. После выделения Т-клеток подсчитывают клетки и культивируют клетки в Т-клеточной расширительной среде или ТКМ в концентрации в два раза 10-шестая клетка на миллилитр. Затем смешайте флакон, содержащий бусины против CD3/CD28, закручивая и выбрасывая необходимый объем бусин в стерильную микроцентрифужную трубку размером 1,5 миллилитра.
Для стирки повторно суспендируйте шарики в одном миллилитре ТКМ, прежде чем поместить трубку на магнит на одну минуту и аспирировать супернатант. После извлечения трубки из магнита повторно суспендируйте вымытые шарики в одном миллилитре ТКМ и повторите стирку дважды. Повторно суспендируют промытые шарики в одном миллилитре ТКМ для переноса их в культуру Т-клеток, затем разбавляют суспензию Т-клеточного шарика ТКМ до концентрации 1,0 раз 10 до шестой клетки на миллилитр перед переносом ее в тканевую культуру, обработанную шестилуночной пластиной.
Инкубируйте плиту скважины при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Чтобы прогрессировать с трансдукцией лентивирусов, разморозьте замороженные лентивирусы в покрытии химерных антигенных рецепторов или натриево-йодидного симпортера при четырех градусах Цельсия. После 24-48 часов стимуляции Т-клеток смешайте Т-клетки, чтобы разбить кластеры и добавить свежеотмороженный лентивирус к клеткам при множественности инфекции в пять.
Инкубируют трансдуцированные Т-клетки при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. На третий, четвертый и пятый дни инкубации подсчитайте трансдуцированные Т-клетки и отрегулируйте концентрацию клеток до 1,0 раз 10-шестых клеток на миллилитр, добавив свежую предварительно нагретую ТКМ. Для NIS-трансдуцированных Т-клеток, несущих ген устойчивости к пуромицину, обработайте клетки одним микрограммом на миллилитр дигидрохлорида пуромицина в третий, четвертый и пятый дни.
На шестой день разбейте кластеры Т-клеток и удалите шарики анти-CD3 / CD28 из трансдуцированных Т-клеток, поместив пластину на магнит на одну минуту. Затем поместите собранные клетки обратно в культуру в концентрации от 1,0 раз 10 до шестой клетки на миллилитр. Промыть аликвоту культуры Т-клеток, содержащей 50 000 клеток с буфером потока, и повторно суспендировать клетки 50 микролитрами буфера потока.
Для обнаружения экспрессии CAR окрашивают Т-клетки одним микролитром козьего антимышьего антитела. Чтобы исключить мертвые клетки, добавьте 0,3 микролитра LIVE/DEAD Aqua. Инкубировать окрашенные клетки в темноте при комнатной температуре.
Через 15 минут промыть клетки 150 микролитрами буфера потока в 650 раз G в течение трех минут при четырех градусах Цельсия. Чтобы зафиксировать и пропитать окрашенные клетки, инкубируйте клетки со 100 микролитрами фиксирующей среды в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Затем дважды промыть клетки 100 микролитрами буфера, содержащего клеточный проникающий агент, такой как сапонин и центрифуга.
После промывки повторно суспендируют пермеабилизированные клетки в 50 микролитрах пермеабилизирующего буфера. Затем добавьте 0,3 нанограмма античеловеческого антитела ETNL NIS и инкубируйте при четырех градусах Цельсия. После одного часа инкубации промыть клетки, добавив 150 микролитров буфера потока и центрифуги, как показано на рисунке.
Затем инкубируют клетки с 50 микролитрами буфера потока, содержащего 2,5 микролитра анти-кроликового вторичного антитела в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. После промывки Т-клеток, как показано, повторно суспендируйте клетки в 200 микролитрах буфера потока для выполнения проточной цитометрии. Затем определяют эффективность трансдукции клеток.
На восьмой день подсчитайте и раскрутите Т-клетки в 300 раз G в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия, прежде чем повторно использовать гранулу клетки с морозильной средой в концентрации 10 раз 10 до шестой клетки на миллилитр. Переложите один миллилитр клеточной суспензии в каждый меченый криобазок для хранения в морозильной камере при минус 80 градусах Цельсия в течение 48 часов. Через 48 часов переведите Т-клетки в жидкий азот.
Подготовьте мышей, которым вводили NIS-положительные Т-клетки BCMA CAR, для визуализации ПЭТ/КТ путем взвешивания мышей и удаления металлических ушных бирок. Затем вводят 9,25 мегабеккереля свежеприготовленного тетрафторбората F18 мыши внутривенно через инъекцию в хвостовую вену. После 45 минут периода поглощения приступайте к получению статических ПЭТ-изображений анестезированной мыши в течение 15 минут, а затем получения изображения КТ в течение пяти минут с поворотом на 360 градусов и 180 проекциями.
В этом репрезентативном анализе котрансдукция двух вирусов в Т-клетки генерировала NIS-положительные BCMA CAR Т-клетки, где более 90% клеток были NIS-положительными. Анализ кинетики роста Т-клеток от нуля до восьми дней показал, что включение BCMA CAR и NIS не оказало существенного влияния на расширение Т-клеток по сравнению с нетрансдуцированными клетками. В проточном цитометрическом анализе OPM-2 клетки, трансдуцированные лентивирусом, представляли экспрессию GFP при лечении пуромицином.
Мыши, получавшие BCMA-положительные люциферазные клетки OPM-2, подвергались биолюминесцентной визуализации для подтверждения приживления клеток OPM-2. ПЭТ-визуализация ферфторбората F18, введенного мышью, выявила NIS-положительное распределение Т-клеток BCMA CAR в различных органах и костном мозге. Кроме того, клетки костного мозга, собранные у мыши, показали приживление клеток OPM-2 и доставку NIS-положительных BCMA CAR T-клеток в костный мозг.
Для получения высококачественной визуализации инфузионных Т-клеток CAR важно следовать шагам протокола генерации Т-клеток NIS CAR и подтвердить наличие двойных положительных фракций NIS и CAR.
