Это модель заболевания сетчатки и эмулирует сетчатку in vivo. В какой-то степени он может заменить эксперименты на животных. Протокол оптимизирован для качества и количества предшественников фоторецепторов в органоидах сетчатки, а фоторецептор является ключом к нескольким необратимым состояниям слепоты.
Начните с культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток, или hESCs, в условиях, свободных от кормушек. Для этого покройте одну лунку шестилуночной пластины одним миллилитом 100 микрограммов на миллилитр реагента А и инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия в течение не менее получаса. Разморозьте аликвоту в один миллион hESC и центрифугируйте ее при 200 xg в течение пяти минут.
После удаления супернатанта засейте клетки в ранее покрытую пластину вместе с двумя миллилитрами реагента B.Проходя клетки после достижения примерно 80%-ной конфлюзии примерно через четыре дня. Достигнув слияния, промыть клетки предварительно подогретым DPBS, и переложить их в 500 микролитров свежеприготовленного реагента. Затем инкубируют клетки в течение 3,5 минут при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
Отсоедините ячейки, щелкнув боковой и нижней частью пластины на несколько секунд, и добавьте 500 микролитров подготовленной среды. Соберите отсоединенные ячейки в новую 1,5-миллилитровую трубку и пипетку клеточной суспензии вверх и вниз. Для подсчета клеток добавьте 100 микролитров клеточной суспензии к 900 микролитрам DPBS.
Разбавьте 900 микролитров оставшейся клеточной суспензии средним в чашке Петри, чтобы достичь девятикратного 10-четвертого уровня мощности ячеек на миллилитр. Добавьте 100 микролитров разбавленной клеточной суспензии к каждой лунке неадгезионной пластины с V-образным дном, 96-луночной пластиной. Слегка вращайте пластину на низкоскоростном шейкере в течение пяти минут и насиживайте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа до второго дня.
На второй день добавьте 20 микролитров 1% реагента А к каждой лунке 96-луночной пластины и пипетку дважды в центре, чтобы рассеять мертвые клетки. Очистите нижнюю часть пластины перед инкубацией при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа до шестого дня. На шестой день замените 58 микролитров среды на 60 микролитров свежей среды и продолжите инкубацию.
На 12-й день соберите гранулы клеток с 96-луночной пластины в 15-миллилитровой конической трубке и дайте гранулам естественным образом осесть в течение пяти минут при комнатной температуре. Когда гранулы осядут, удалите супернатант, не нарушая органоидов, и перенесите клеточные агрегаты в 10-сантиметровую суспензионную чашку, содержащую 18 миллилитров среды два с реагентом A.Инкубируйте блюдо при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа до 18 дня. На 18-й день подтвердите генерацию полупрозрачного зрительного пузырька в посуде и вырежьте сгенерированные органоиды с помощью микрохирургического ножа.
Сложите все нарезанные гранулы к центру блюда. Затем соберите клетки в 15-миллилитровую коническую трубку Falcon. Когда клетки осядут, аккуратно удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулы в двух 10-сантиметровых чашках Петри с 18 миллилитрами среды, по три на чашку.
Аккуратно перенесите посуду в инкубатор, чтобы избежать агрегации клеток. Продолжайте культивировать клетки, меняя среду еженедельно. Анализ экспрессии CRX после 45-го дня до 120-го дня.
В этом репрезентативном анализе отображаются различные стадии генерации сетчатки человека. На шестой день органоиды появились в виде совокупности плотных соединений внутри яркого обода диаметром около 600 микрометров. На 12-й день произошло первоначальное поколение оптических пузырькообразных структур.
Органоиды без надлежащей пузыреобразной архитектуры были выброшены перед культивированием в чашке Петри на 18-й день. К 30-му дню культуры архитектура, похожая на везикл, была более очевидной, и более низкие RO можно было легко различить и удалить. Начиная с 45-го дня, органоиды экспрессировали различные маркеры предшественников фоторецепторов, таких как CRX, RCVRN и OTX2.
Путем расщепления высших органоидов сетчатки эффективность дифференцировки значительно улучшается, и можно извлечь более 100 высших органоидов из 96 пластин.
