Разработка новых методов лечения метастазов в ЦНС была затруднена из-за отсутствия хороших доклинических моделей. Наши модели ксенотрансплантатов, полученные от пациентов, повторяют метастазы в ЦНС лучше, чем исторически используемые модели клеточных линий. Используя различные пути инокуляции опухоли, вы можете изучать различные аспекты метастатического каскада.
Каждый маршрут имеет преимущества, которые можно использовать для вашего обучения. Продемонстрирует процедуру Бен Йи Тью, научный сотрудник моей лаборатории. Для подкожной боковой имплантации криоконсервированных опухолей PDX быстро разморозьте криоконсервированную опухолевую ткань на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия.
Затем промойте его в пяти миллилитрах DPBS в чашке для культивирования тканей. Затем, после подтверждения анестезии у самки мышей NOG в возрасте от трех до восьми недель, сделайте разрез от 0,5 до одного сантиметра на левом или правом боку и вставьте один кусочек опухолевой ткани размером 2x2x2 миллиметра глубоко в карман. После закрытия разреза дайте мыши восстановиться после анестезии с мониторингом, пока она не станет амбулаторной.
Как только опухоль начнет расти, измеряйте опухоль три раза в неделю штангенциркулем. В соответствующей экспериментальной конечной точке идентифицируют метастазы с помощью вскрытия и подтверждают наличие опухолей в органе-мишени с помощью гистологического анализа. Поместите резецированную опухоль PDX в DMEM на лед.
Промойте опухоль в пяти миллилитрах DPBS в чашке для культивирования тканей и удалите некротические участки, если таковые имеются. Разрежьте опухоль на небольшие кусочки длиной от двух до четырех миллиметров и перенесите кусочки в пробирку с диссоциирующим раствором. Используя соответствующую программу на диссоциаторе, механически диссоциируйте ткань и процедите полученную клеточную суспензию через 70-микрометровый клеточный фильтр.
Используйте 20 миллилитров DMEM, чтобы вымыть все оставшиеся клетки из ситечка и центрифугировать диссоциированную клеточную суспензию. Затем ресуспендируйте клетки и DPBS для подсчета и отрегулируйте клетки до концентрации от пяти до 10 раз от 10 до четвертых клеток на один-два микролитра DPBS. Чтобы подготовить операционную область, сбрейте шерсть на голове мыши, чтобы обнажить кожу головы.
Затем поместите мышь в стереотаксическую рамку, надежно закрепив голову мыши с помощью ушных брусьев. Не забудьте также ввести соответствующий анальгетик. Продезинфицируйте кожу головы тремя чередующимися скрабами из повидон-йода и 70% этанола.
Сделайте продольный разрез толщиной от пяти до семи миллиметров, чтобы обнажить череп и втянуть кожу головы. Соскребите надкостницу щипцами, чтобы найти брегму. Расположите стрелку стереотаксической рамки поверх брегмы и сбросьте координаты на ноль.
Переместите руку на один миллиметр назад и на один миллиметр сбоку вправо от средней линии и отметьте это место перманентным маркером. Затем просверлите небольшое отверстие в черепе в отмеченном месте, стараясь не просверлить мозг. Загрузите в пятилитровый шприц Гамильтона 26-го калибра один-два микролитра клеток и прикрепите шприц к стереотаксической руке.
Медленно вставьте иглу на два миллиметра в мозг и начните вводить клетки с нужной скоростью. Когда все клетки будут доставлены, медленно втяните иглу, заполните отверстие для заусенцев костным воском и закройте разрез. Поместите мышь обратно в клетку с наблюдением до тех пор, пока она не оправится от анестезии.
После эвтаназии животного в соответствующей экспериментальной конечной точке подтвердите наличие опухолей в головном мозге с помощью гистологического анализа. Чтобы имплантировать опухоли PDX путем внутрисердечной инъекции, подготовьте опухолевые клетки, как показано, и поместите анестезированную мышь-реципиента в положение лежа на спине. Сбрейте шерсть на груди животного и продезинфицируйте открытые участки кожи повидон-йодом и 70%-ным этанолом.
Наберите от 0,5 до 10 раз от 10 до пятых опухолевых клеток и до 100 микролитров DPBS в шприц, оснащенный иглой 28 калибра. Найдите место инъекции немного левее грудины на полпути между стернальной выемкой и мечевидным отростком. Затем вставьте иглу вертикально в мышь в месте инъекции.
Как только наблюдается обратный поток, указывающий на успешное введение иглы в левый желудочек, медленно дозируйте суспензию опухоли в левый желудочек, не перемещая иглу. Когда все клетки будут доставлены, медленно и вертикально втяните иглу и приложите кусок стерильной марли к месту инъекции примерно на одну минуту, пока кровотечение не остановится. Дайте мыши восстановиться на грегретой подушке с мониторингом, пока она не станет амбулаторной.
В соответствующей экспериментальной конечной точке идентифицируют метастазы с помощью вскрытия и подтверждают наличие опухолей в органе-мишени с помощью гистологического анализа. Несмотря на различия в микроокружении опухоли, опухоли PDX демонстрируют сходную морфологию, содержащую клетки с мелкими ядрами и скудной цитоплазмой, независимо от места имплантации. В этом анализе внутрисердечная инъекция клеток меланомы человека привела к метастазам опухолевых клеток в мозг мыши, в то время как внутрисердечная инъекция метастазирующих в мозг опухолевых клеток мелкоклеточного рака легкого человека привела к метастазированию в брюшную полость и печень мыши.
Эти протоколы позволяют проводить доклинические исследования для тестирования новых методов лечения и комбинаций лечения, а также могут помочь в изучении биологических процессов и метастазирования опухоли.
