Этот протокол использует два различных полуавтоматических анализа для быстрой количественной оценки двигательной активности C.elegans в жидкой среде и может быть применен для скрининга лекарств в моделях болезни C.elegans. Основными преимуществами этих двух методик являются их простота использования и легкость воспроизводимости. Оба метода имеют потенциал для оценки влияния лекарств на поведение червей с переменной пропускной способностью.
Эти анализы подвижности полезны для оценки двигательной активности моделей митохондриальных заболеваний C.elegans, в которых нарушается нервно-мышечная система животных. Для анализа двигательной активности C.elegans в жидкой среде на стеклянных слайдах после синхронизации контроля в штаммах мутантных червей на пластинах NGM с лекарственными препаратами, представляющими интерес для стадии L4, и без них, используйте червячный отмычек и стереомикроскоп для выбора пяти червей на штамм и состояния в отдельные 20 микролитровых капель раствора S.basal на стеклянной горке. Добавьте червей из одного и того же экспериментального состояния из разных пластин NGM в несколько капель на одном слайде, чтобы получить несколько технических реплик.
Когда все черви будут собраны, позвольте животным акклиматизироваться на слайде в течение одной минуты при комнатной температуре, прежде чем записывать активность плавания червей в каждой капле в течение одной минуты со скоростью 15 кадров в секунду на каплю. Чтобы проанализировать записанную двигательную активность C.elegans с помощью программного обеспечения ZebraLab, используйте опцию ZEBRALAB AVI для загрузки видео в программное обеспечение. Выберите параметр Квантование с помощью файлов AVI.
Чтобы создать новый протокол, выберите Параметры, Параметры протокола и Время и задайте продолжительность эксперимента в одну минуту. Выберите No Time Bin и снимите флажок Период интеграции в соответствии с требуемым выводом данных, а затем выберите Файл и Открыть фильм, чтобы загрузить каждый отдельный ранее записанный видеофайл. Чтобы построить одну область обнаружения, используйте инструмент «Круг», чтобы создать область вокруг всей капли жидкости, в которой находятся черви.
Активность всех червей в выбранной области будет обнаружена. Чтобы указать расстояние для калибровки, нарисуйте горизонтальную линию слева направо от области видео и выберите Калибровка, Рисование и Применение к группе. Чтобы разрешить обнаружение всех различных анализируемых штаммов червей C.elegans, снимите флажок «Область» и отрегулируйте чувствительность обнаружения в пороговом значении активности.
Чтобы визуализировать следы, сделанные животными во время анализа активности, установите для шкалы отображения значение 70 и выберите Применить к группе. Чтобы проанализировать видео, нажмите кнопку Воспроизвести, а затем выберите Эксперимент и Выполнить, чтобы ввести имя файла для видео. После сохранения появится окно с вопросом, стоит ли анализировать видео на максимальной скорости компьютера.
Нажмите кнопку Да. Откроется окно запущенного эксперимента. Нажмите кнопку Пуск.
После завершения анализа записи нажмите кнопку Эксперимент и остановитесь, чтобы сохранить действие, проанализированное в дроплете, в электронной таблице. Для анализа локомоторной активности C.elegans в жидкой среде в формате пластины с 96 лунками, когда черви достигли стадии L4, добавляют 50 микролитров массой 2% на объем E.coli OP50 и S.базальной среды к каждой скважине прозрачной 96-луночной плоскодонной микропластины. Используйте стереомикроскоп, чтобы вручную выбрать 15 синхронизированных червей на скважину 96-скважинной пластины и позволить червям акклиматизироваться в течение 20 минут.
В конце периода акклиматизации используйте стандартный планшетный сканер для сканирования каждой микропластины два раза с менее чем 10 секундами между сканированиями Чтобы проанализировать сканирование, используйте программное обеспечение с открытым исходным кодом для выравнивания двух последовательных сканирований и получения данных об изменении пикселей между двумя изображениями и относительной оценки сканирования червя для определения изменений в локомоторном отклике на основе интенсивности света, производимой сканером при установке на пиксель порог в пять. В этом анализе двигательной активности C.elegans в одной капле жидкой среды митохондриальный комплекс I глистов продемонстрировал значительное снижение их локомоторной активности на стадии L4 на 38% по сравнению с червями дикого типа. Аналогичным образом, анализ сканирования червей тех же популяций показал значительное снижение двигательной активности для червей модели болезни L4 по сравнению с червями дикого типа N2 Bristol.
Эта потеря активности локомотива также наблюдалась у взрослых червей митохондриального комплекса I, оцененных с помощью анализа сканирования червей. Важно помнить об использовании правильного количества червей при настройке каждого анализа. После этой процедуры наша лаборатория часто проводит скрининг на наркотики.
Эти два метода используются в нашей лаборатории для оценки влияния препаратов, представляющих интерес, на активность червей в доклинических животных моделях митохондриальных заболеваний.
