Митохондриальная функция имеет решающее значение для клеточного гомеостаза, а уровень потребления кислорода является решающим показателем митохондриального здоровья. Этот протокол содержит подробные инструкции по анализу скорости потребления кислорода в C.elegans. Этот протокол использует живые, мобильные C.elegans, обеспечивающие юридическое измерение митохондриальной функции.
Повышение необходимости изолировать митохондрии, шаг, который потенциально может повлиять на его целостность. Для начала перенесите личинки L4 желаемого генетического происхождения на свежесеянную лужайку кишечной палочки на нематодные средства роста или NGM пластины. Используйте по крайней мере две 100 мм или три 60 мм пластин для каждого штамма.
Инкубировать червей при соответствующей температуре роста в течение трех-четырех дней, или до тех пор, пока пластины сосредоточены с большим количеством яиц и гравийных червей. Вымойте яйца и червей с пластин, используя примерно 6 миллилитров буфера M9 на 100 миллиметров пластины нематод. Используя стеклянные пипетки пастбища, перенесите яйца и червей в отдельные 15 миллилитровых центрифуг для каждого штамма.
Спиновые пробирки трубки вниз в течение трех минут на 6, 180 г. После центрифугации, аспирировать из буфера M9 сохраняя только животное и яйцо гранулы. Добавьте три-четыре миллилитров раствора отбеливателя в каждую трубку и периодически вихрь в течение шести минут.
Затем добавьте буфер M9, чтобы заполнить каждую трубку и вращаться на 6, 180 г в течение одной минуты. Аспирировать супернатант и повторить эту стирку с M9, три раза. После мытья перемести яичные гранулы в свежую 15-миллилитровую трубку, содержащую примерно девять миллилитров буфера M9.
Синхронизировать свежевылупившихся червей, орехи при 20 градусах по Цельсию в течение 16 до 48 часов. После спиннинг этих труб вниз на 6, 180 г в течение 1,5 минут, положить синхронизированных L-1 животных вниз на свежесеянной лужайке OP50 на отдельных ngM пластин. Держите пластины на 20 градусов по Цельсию, пока животные не достигнут стадии личинки L-4 примерно через 42 часа.
В это время используйте платиновый выбор для перемещения личинок L4 в пластины OP50, содержащие 0,5 миллиграмма на миллилитр FUdR, чтобы предотвратить производство потомства. Гидратировать картридж датчика, добавив 200 микролитров дистиллированной воды в каждую колодец на пластине, гарантируя, что датчик зонды погружены. Храните тарелки на ночь при комнатной температуре.
Выключите нагревательный элемент в интерфейсе респирометра. Хранение машины внутри инкубатора по Цельсию на 15 градусов снижает температуру ядра в машине и предотвращает перегрев животных во время анализа. После ночной инкубации, пипетка и отказаться от дистиллированной воды, используемой для гидратации датчика зондов, и заменить его 200 микролитров раствора калибранта в каждой хорошо.
Разбавить раствор акций FCCP до 100 микромолейных FCCP в дистиллированной воде. Затем добавьте 20 микролитров разбавленного раствора для впрыска порта А в сенсорный картридж. Добавьте 22 микролитров 400 миллимолярные азиды натрия для впрыска порта B сенсорного картриджа.
Теперь включите респирометр. На домашнем экране выберите начало и появятся страницы шаблонов. На странице шаблонов выберите пустой"или ранее разработанный шаблон.
Страница групп будет отображаться. На странице групп выберите скважины A и H в качестве фоновых скважин и назначьте оставшиеся шесть скважин соответствующим группам в соответствии с экспериментальным планом. Получите доступ к странице протокола, нажав на стрелку в правом нижнем праве, и убедитесь, что равновесные, базальные и инъекции одной и двух кнопок выбраны.
Отрегулируйте количество показаний базального OCR, а также максимальный OCR и не митохондриальный OCR. Выберите стрелку в правом нижнем углу. Появится подсказка для загрузки сенсорной пластины картриджа.
Убедитесь, что пластина картриджа датчика загружается в нужной ориентации, следуя инструкциям на экране напоминания. Респирометр теперь будет уравночные картриджа. Добавьте 200 микролитров буфера M9 в каждую из восьми скважин и окружающих резервуаров клеточной пластины.
Выберите около 100 червей из каждого штамма на несеяные пластины NGM, и дайте отдохнуть в течение двух-трех минут. Затем, мокрый конец платины забрать с буфером M9 и выбрать 20 возрастных синхронизированных животных в скважины B через G, в результате чего фоновые скважины А и H пусто. Теперь нажмите OK на программное обеспечение респирометра, чтобы извлечь пластину, содержащую буфер калибровки.
Снимите пластину с респирометра, оставив сенсорный картридж внутри прибора. Замените калибрантную пластину пластиной, содержащей животных. Загрузите пластины и закройте дверь, нажав продолжать и позволяют анализ для запуска.
После того, как анализ запустить завершена, следуйте подсказки на экране, чтобы удалить пластину ячейки и датчик картриджа. Вставьте флэш-накопитель в порт USB, чтобы сохранить формат войны данных. Удалите сенсорный картридж и позвольте животным осесть на дне колодцев в течение примерно двух минут.
Поместите клеточные пластины под стерео рассечение микроскопа и подсчитайте количество животных на колодец. Откройте программное обеспечение для анализа, а затем вкладку нормализации, чтобы нормализовать уровень потребления кислорода до числа животных. Примените соответствующие уровни для различных групп в соответствии с изменением "таб, и экспортировать файл в качестве призмы файл для дальнейшего анализа.
Среднее значение первых пяти измерений составляет базальный OCR. Среднее значение пяти измерений после добавления FCCP является максимальным OCR. Наконец, среднее значение последних пяти измерений после добавления азида натрия – это нетихондриальная частота дыхания.
Поскольку дисрегуляция кальция может привести к изменению митохондриальной функции, OCR как у мутантов sel-12, так и у диких животных был измерен для изучения влияния мутаций sel-12 на митохондриальную функцию и здоровье. Дикие животные типа последовательно показали базальные ставки OCR ниже пяти пикомолов в минуту, на червя. В то время как все три штамма мутантов sel-12 показали значительно повышенный OCR, приблизительно семь пикомолов в минуту, на червя.
Помимо FCCP, произошло увеличение OCR дикого типа, а также сель-12 мутантов, как и ожидалось. Дикие животные типа показали максимальный OCR приблизительно семь пикомолов в минуту, на червя. В то время как мутанты sel-12 имели OCR приблизительно 10 пикомолов в минуту, на червя.
Используйте живых, хорошо кормили, и асинхронизированных животных в этом анализе, и избежать передачи яиц или туш в анализ скважин. Кроме того, внутренняя температура прибора не должна превышать 25 градусов по Цельсию. Отбеливатель, FCCP, FUdR и азид натрия токсичны.
Поэтому следует позаботиться о том, чтобы носить защитные перчатки при подготовке фондовых растворов и загрузке лекарств.
