Понимание эффективности лекарств на животных моделях является дорогостоящим и трудоемким. Наш протокол, который использует модель ex vivo tissue explant, значительно ниже как с точки зрения стоимости, так и научного персонала, необходимого для проведения исследования. Основным преимуществом этой методики является использование свиных глаз, которые имеют анатомию и физиологию, очень похожие на человеческие глаза в отличие от некоторых других моделей мелких животных.
Когда мы тестируем лекарства in vitro, они могут показать эффективность, которая может отсутствовать на животных или человеческих моделях. Тканевые системы ex vivo — лучший способ понять, могут ли наши системы in vitro быть переведены в испытания на животных и людях. Система роговицы свиней, хотя и менее трудоемкая, требует обучаемых навыков для выделения, поддержания, заражения и лечения препаратами, особенно процесс выделения роговицы из всего свиного глаза сложно выразить словами, но требует визуальной демонстрации.
Получив глаза свиней от подходящего продавца, храните ткани на льду до обработки и надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты. Продезинфицируйте рабочую зону 70% этанолом и закрепите крышку скамейки на рабочем месте. Когда рабочая зона будет готова, поместите глаза на 50-миллиметровый кусок марли и используйте марлю, чтобы захватить задний отдел одной рукой.
Используя иглу 30 калибра, осторожно сделайте один прокол примерно в центре эпителиальной поверхности глаза, следя за тем, чтобы не повредить строму, и используйте острое стерилизованное лезвие, чтобы сделать небольшой разрез на склере на расстоянии одного миллиметра от роговицы. Используя быстрое и плавное вращающееся действие руки и заботясь о том, чтобы стекловидное тело не протекала, срежьте край роговицы и удерживая роговицу у края роговицы-склеры плоским пинцетем, используйте лезвие, чтобы отрезать оставшиеся привязные мембраны. По мере выделения каждой роговицы поместите ткани лицевой стороной вверх в отдельные лунки из 12-луночной пластины, содержащей два миллилитра среды роговицы на лунку, и добавьте пять микролитров пять раз 10 к пятой бляшеобразующей единице из 17 раствора вируса GFP к санированной площадке на поверхности каждой роговицы.
Когда все роговицы будут собраны, поместите пластину в инкубатор с диоксидом 5% в течение 72 часов и распылите любые дополнительные глаза, не используемые в эксперименте, 10% отбеливателем для их безопасной утилизации в мешках биологической безопасности. Каждый день перед добавлением препаратов помещают пластинку роговицы под стереомикроскоп и выбирают фильтр GFP и время воздействия 500 микросекунд. Захватите изображения с наименьшим увеличением, прежде чем визуализировать роговицу с серией увеличивающихся увеличений, пока все вирусное распространение и образование дендритов не будут четко визуализированы.
Когда все роговицы будут сфотвоированы, верните пластину в инкубатор культуры тканей. За день до заражения промыть культуру клеток веро два раза по 10 миллилитрам PBS за промывку и обработать клетки одним миллилитром 0,05% трипсина на лунку в течение пяти-10 минут при 37 градусах Цельсия. Когда клетки отделяются, используйте девять миллилитров целой среды, чтобы гарантировать, что клетки полностью вытесняются с поверхности колбы и переносят полученную суспензию ячейки в 15-миллилитровую центрифужную трубку.
Добавьте 300 микролитров клеток в каждую лунку новой шестиямямяя пластины с последующим добавлением двух миллилитров среды к каждой лунке, затем поместите пластину в инкубатор клеточной культуры на ночь. На следующее утро, чтобы собрать вирус из каждой роговицы для количественной оценки, замочите стерильные ватные тампоны в 500 микролитрах безымяточной среды на тампон в нескольких микроцентрифужных трубках в шкафу биобезопасности не менее пяти минут. В конце инкубации аккуратно поместите зараженные культуры роговицы свиней в шкаф.
Используя влажные ватные тампоны, сделайте три оборота по часовой стрелке и три оборота против часовой стрелки в пяти миллиметрах от центра каждой зараженной роговицы свиньи, не применяя чрезмерного давления. В конце серии оборотов поверните каждый тампон в своей безсыворочной среде, заполненной микроцентрифугой трубкой по часовой стрелке и против часовой стрелки пять раз, прежде чем разрезать тампоны так, чтобы наконечники помещались в каждую трубку с закрытой крышкой. Когда все роговицы будут промаснуты, вихрьте трубки на высокой скорости в течение одной минуты.
Чтобы количественно оценить количество вируса, собранного из каждой роговицы, подготовьте 10-кратное разведение вируса в безсыворочной среде в микроцентрифужных пробирках до тех пор, пока не будет достигнуто разведение от одного раза 10 до отрицательных восьми. После аспирации питательной среды из каждого колодца клеток переводят один миллилитр каждого разведения вируса, начиная с одного раза 10 до отрицательных трех, на покрытые клеточные монослои и помещают инфицированные клетки в инкубатор клеточной культуры на два часа. В конце инкубации осторожно промыть каждую лунку два раза PBS, прежде чем добавлять два миллилитра метилцеллюлозной среды в каждую лунку для 72-часовой инкубации или до тех пор, пока не будет наблюдаться образование бляшек.
При наблюдении за бляшками медленно добавляйте по одному миллилитру метанола в угол каждой лунки для 15-минутной инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации медленно аспирировать содержимое из каждой скважины, не нарушая клеточный монослой. Затем пометьте каждую лунку одним миллилитром кристаллического фиолетового рабочего раствора, заботясь о том, чтобы все клетки были покрыты для 30-минутной инкубации, защищенной от света.
В конце инкубации выбросьте раствор и высушите колодцы на листе абсорбирующей бумаги, затем подсчитайте количество бляшек в самой высокой разбавленной скважине, чтобы количественно оценить общее содержание вируса в исходном растворе три раза. Как отмечено в этом стереоскопическом флуоресцентном анализе, противовирусная эффективность BX795 аналогична эффективности TFT в контроле распространения вируса, в то время как роговицы, обработанные транспортным средством, демонстрируют распространение вируса из центральной инфекционной зоны на периферию только через шесть дней после первоначальной вирусной инокуляции. Аналогичным образом, глазные мазки, взятые на второй и четвертый дни после заражения, демонстрируют полное ингибирование вируса в положительных контрольных и обработанных BX795 образцах, в то время как резкое увеличение титра инфекционного вируса наблюдается в отрицательных контрольных образцах.
Выделение роговицы свиньи из всего свиного глаза является наиболее важным шагом. Шаги 2.3-2.6 являются наиболее важными в этом процессе. Наша модель может быть использована для понимания дендритного распространения вируса в роговицах свиней.
Этот метод может быть распространен на бактериальные и грибковые инфекции. Этот метод помог визуализировать дендритное распространение вируса в роговице за пределами человеческой модели. Эта модель полезна для тестирования эффективности лекарств перед переходом к испытаниям на животных и людях.
