Этот метод позволяет выращивать бактерии в среде, которая вызывает сходную физиологию клеток и морфологию биопленки с той, которую вы видите при инфекциях легких муковисцидоза. Легкие являются отходами в мясной промышленности, поэтому этических проблем нет. Модель предлагает платформу для имитации инфекции человека без необходимости в живой животной модели.
Этот метод дает исследователям новый способ скрининга лекарств-кандидатов на возможность входить и разрушать биопленки, которые образуются в легких муковисцидоза. С дальнейшим развитием и валидацией мы считаем, что модель EVPR может иметь потенциальное применение для специализированного и индивидуализированного тестирования чувствительности к антибиотикам. Добывайте легкие сразу после убоя и транспортировать их в лабораторию в домашней прохладной коробке.
Работа на стерилизованной поверхности и под пламенем. Поместите легкие на чистую пластиковую разделочную доску, покрытую автоклавной алюминиевой фольгой, и проверьте, чтобы бронхиолы остались нетронутыми. Легкие не пригодны для использования, если на скотобойни или во время транспортировки были какие-либо повреждения.
Нагрейте нож поддоном под пламенем и очень коротко прикоснитесь ножом к области легкого, окружающей бронхиолу, чтобы стерилизовать поверхность ткани. Отрежьте поверхностную ткань, окружающую бронхиолу, используя стерильное лезвие бритвы, делая разрезы параллельно бронхиоле, чтобы предотвратить любое повреждение. После того, как бронхиола была обнажена, сделайте поперечный разрез через бронхиолу в самой высокой видимой точке.
Используя стерильные щипцы, слегка удерживайте свободный конец бронхиолы и отрежьте любую оставшуюся нежелательную ткань с помощью стерильного лезвия бритвы. Сделайте окончательный поперечный разрез через бронхиолу, прежде чем будет видно какое-либо ветвление, чтобы удалить бронхиолу из легких. Поместите бронхиолу в первую промывку DMEM RPMI 1640.
Оставьте его в промывке и соберите дополнительные участки бронхиол из того же легкого, чтобы получить достаточное количество участков ткани для запланированного эксперимента. Поместите любые дополнительные бронхиолярные участки из того же легкого в промывку и оставьте их в промывке не менее чем на две минуты. Извлеките бронхиолы из первой промывки и поместите образцы в стерильную чашку Петри.
Слегка удерживайте каждую бронхиолу стерильными щипцами, заботясь о том, чтобы не повредить ткани. Удалите как можно больше оставшихся мягких тканей и разрежьте ткань на полоски шириной пять миллиметров с помощью стерильных ножниц для рассечения. Поместите все полоски бронхиолярной ткани во вторую промывку DMEM RPMI 1640.
Оставьте их в стирке не менее чем на две минуты, затем удалите полоски ткани из второй стирки стерильными щипцами и поместите их в чистую, стерильную чашку Петри. Удалите все оставшиеся мягкие ткани, прикрепленные к бронхиоле, и разрежьте полоски на квадраты с помощью стерильных ножниц для рассечения. Добавьте третью смывку DMEM RPMI 1640 в чашку Петри и слегка перемешайте кусочки ткани в стирке, закручивая посуду.
Вылейте третью промывку из чашки Петри, не удаляя кусочки ткани. Затем добавьте окончательную промывку SCFM, убедив, что все кусочки ткани покрыты. Стерилизуйте ткани в SCFM под ультрафиолетовым светом в течение пяти минут.
Используйте стерильные щипцы для переноса каждого стерилизованного кусочка бронхиолярной ткани в отдельные колодцы из 24-х скважинной пластины, содержащей агарозные прокладки SCFM. Чтобы заразить каждый кусочек ткани желаемым бактериальным штаммом, прикоснитесь к колонии, выращенной на агаровой пластине, кончиком иглы 29-го калибра, прикрепленной к стерильному 0,5-миллилитрового инсулинового шприца, затем коснитесь колонии на куске ткани, осторожно прокалывая поверхность. Для неинфицированных контрольных органов осторожно проколите поверхность кусочка ткани кончиком иглы, затем используйте пипетку, чтобы добавить 500 микролитров SCFM в каждую лунку.
Стерилизуйте дышащей уплотнительной мембраной для каждой 24-скважинной пластины под ультрафиолетовым светом в течение 10 минут. Снимите крышку с 24-колодезной пластины и замените ее дышащей мембраной, затем высиживают пластины при 37 градусах Цельсия без встряхивания. Настройте реплицированные наборы легочных кусочков по крайней мере из двух независимых легких, используя один набор для отрицательного контроля и один набор на каждую концентрацию антибиотика, который будет протестирован.
После 48 часов инкубации визуально осмотрите неинфицированные кусочки ткани на предмет роста эндогенных бактерий, которые приведут к тому, что среда вокруг этих участков будет мутной. Если наблюдается рост, характерный для выбранного исследуемого вида, возобновим эксперимент со свежими легкими. Если неинфицированные участки ткани не показывают никакого или минимального роста бактерий, подготовьте одну 24-хорошую промывочную пластину и одну 24-хорошую обработочную пластину.
Каждая лунка лечебной пластины должна содержать 500 микролитров свежего SCFM без антибиотиков или с антибиотиком, представляющим интерес. Удалите каждый зараженный кусочек ткани из инкубационной пластины с помощью стерилизованных щипцами. Закрутите его ненадолго в свежем колодце промывной пластины, чтобы удалить любые бактериальные клетки, не связанные с биопленкой, и перенести их в соответствующий колодец лечебной пластины.
Запечатайте лечебную пластину свежей дышащей мембраной, затем высиживайте ее при 37 градусах Цельсия без встряхивания в течение 18-24 часов. Используйте огненно-стерилизованные щипцы, чтобы удалить каждый кусок легкого из 24-луночной пластины, и поместите его в стерильную двухмиллилитровую гомогенизационную трубку, содержащую один миллилитр PBS и один грамм металлических шариков. Бисер бьется в течение 40 секунд со скоростью четыре метра в секунду.
Последовательно разбавляйте гомогенат легких с помощью PBS и наносите его на агар LB, чтобы определить колониеобразующие единицы в отдельных, необработанных и обработанных антибиотиками кусочках ткани. При выращивании в легких свиньи ex-vivo или EVPL биопленки P.aeruginosa и S.aureus демонстрируют повышенную толерантность к антибиотикам по сравнению с восприимчивостью в стандартных, одобренных промышленностью анализах MIC и дисках бульона с использованием стандартных сред. Различные эффекты различных антибиотиков на биопленку, установленную EVPL, различимы.
Например, убийство P.aeruginosa достигается при EVPL с 4 до 16X МИК ципрофлоксацина, но не с 4-8X МИК хлорамфеникола. Популяции S.aureus, которые восприимчивы к линезолиду в дисковом анализе, способны выживать в целевых концентрациях в сыворотке и выше при EVPL. Даже оптимизированный анализ in vitro не может точно предсказать восприимчивость P.aeruginosa к колистину в EVPL.
Количество антибиотика, необходимое для достижения трех log 10 уничтожения бактерий, выращенных EVPL, часто значительно выше, чем MIC или MBEC, рассчитанные на основе стандартных анализов in vitro. В дополнение к различию различий между антимикробными агентами, эта модель может выделять изменения восприимчивости на разных стадиях роста бактерий и для разных интервалов дозирования антибиотиков. Здесь показана возрастающая толерантность биопленок P.aeruginosa к меропенему по мере их созревания.
Выживаемость S.aureus измеряли через 4 и 24 часа после воздействия флуклоксациллина, что позволило наблюдать различия в снижении количества бактериальных клеток во времени и между изолятами. Вариации бактериальной нагрузки часто увеличиваются с увеличением времени культивируется. Это можно увидеть в необработанный контроль после 48-часового развития биопленки и дальнейшего 24-часового воздействия, чтобы учесть интервал дозирования антибиотиков.
Крайне важно поддерживать отличную стерильную технику на протяжении всего рассечения, поэтому мы рекомендуем делать вскрытие в лаборатории или в области вашей лаборатории, которую вы никогда не используете для микробиологической работы. Недавно мы использовали модель для изучения поступления колистина в биопленку, и модель имеет хороший потенциал для использования в исследованиях по улучшению доставки лекарств в биопленки.
