Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы предоставить подробное руководство по использованию минигена E1A2 для оценки глобальных изменений сплайсинга мРНК. Это быстрый, недорогой и простой инструмент для оценки функции белка-мишени в альтернативной регуляции сплайсинга без необходимости специальных режимов или лабораторных условий. Начните с культивирования клеток HEK 293 со стабильной экспрессией интересующего гена.
Разделите клетки с использованием 0,25% трипсина ЭДТА, затем наложите 300 000 клеток на скважину в шестияместных пластинах и инкубируем их в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия в 5% углекислого газа. Через 24 часа проверяют слияние и трансфектируйте стабильные клетки HEK 293 только при 70-80% слиянии. Аккуратно удалите питательную среду с пипеткой, затем добавьте два миллилитра полной среды DMEM без антибиотиков и положите пластину обратно в инкубатор.
Подготовьте пробирку с трансфекционным буфером, затем добавьте два микрограмма ДНК pMTE1A, вихрь и добавьте два микролитра трансфекционного реагента. Снова вихрь и насиживающий в течение 10 минут при комнатной температуре. Снимите пластины с инкубатора и осторожно добавьте трансфекционную смесь по каплям.
Через шесть часов после трансфекции добавляют тетрациклин в стабильные клетки HEK 293 для индукции экспрессии Nek4. Через 24 часа после трансфекции проверьте морфологию клеток и эффективность трансфекции с помощью флуоресцентного микроскопа. Используйте пипетку, чтобы удалить среду клеточного культивирования, затем добавьте среду для культивирования клеток с химиотерапевтическими препаратами.
Инкубируют клетки еще 24 часа. Чтобы собрать РНК, отбросьте среду клеточного культивирования и добавьте от 0,5 до 1 миллилитра реагента для экстракции РНК непосредственно в лунку. Если лунки очень слиты, используйте один миллилитр реагента экстракции РНК для улучшения качества РНК.
Гомогенизируйте клетки пипеткой и перенесите их в 1,5-миллилитрную центрифужную трубку. Немедленно приступайте к экстракции РНК или храните образцы при минус 80 градусах Цельсия. Разморозить образцы в вытяжке и инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре.
Добавьте от 0,1 до 0,2 миллилитра хлороформа и энергично перемешайте, затем инкубировать в течение трех минут при комнатной температуре. Центрифуга в течение 15 минут при 12 000 раз G и четырех градусах Цельсия, затем соберите верхнюю водную фазу и перенесите ее в новую 1,5-миллилитровую центрифужную трубку. Соберите около 60% от общего объема, но не соберите ДНК или органическую фазу.
Добавьте от 0,25 до 0,5 миллилитров изопропанола и перемешайте образец путем инверсии четыре раза. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре, затем центрифугировать при 12 000 g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и выбросить супернатант. Дважды промыть гранулу РНК этанолом и центрифугировать по 7 500 раз g в течение пяти минут, затем выбросить этанол.
Удалите избыток этанола, перевернутый тюбик на бумажном полотенце, затем оставьте трубку открытой внутри вытяжного капюшона, чтобы частично высушить гранулу в течение пяти-10 минут. Повторно суспензить гранулу РНК в 15 микролитрах воды, обработанной DEPC. Количественно оцените общую РНК и проверьте качество РНК, измерив поглощение на 230, 260 и 280 нанометрах.
Чтобы проверить общее качество РНК, запустите 1%-агаразный гель, предварительно обработанный 1,2% 2,5% раствора гипохлорита натрия в течение 30 минут. Выполняют синтез кДНК с использованием одного-двух микрограммов общей РНК. Объедините РНК, один микролитр олиго d-T, один микролитр DNTP и воду без нуклеазы до 12 микролитров.
Инкубировать реакцию в термоциклере в течение пяти минут при 65 градусах Цельсия. Извлеките образцы из термоциклера и добавьте четыре микролитра буфера обратной транскриптазы, два микролитра DTT и один микролитр ингибитора рибонуклеазы. Инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение двух минут.
Добавьте один микролитр термостабивной обратной транскриптазы и инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 50 минут. Инактивировать фермент при 70 градусах Цельсия в течение 15 минут. Выполните ПЦР, как описано в текстовой рукописи, затем загрузите от 20 до 25 микролитров продукта ПЦР на 3%-агарозный гель, содержащий окрашивание нуклеиновой кислоты, и проведите при 100 вольтах в течение примерно одного часа.
Сфотографируйте гель, избегая насыщения полосы, и количественно оцените полосы с помощью программного обеспечения для обработки изображений. Полосы в 631, 493 и 156 парах оснований соответствуют изоформам 13S, 12S и 9S соответственно. В меню «Файл» программного обеспечения откройте файл изображения и преобразуйте его в серую шкалу.
Отрегулируйте яркость и контрастность, а затем при необходимости удалите шум, выжидающиеся. Нарисуйте прямоугольник вокруг первой полосы с помощью инструмента выделения прямоугольника и выделите его с помощью команд «Анализировать», «Гели» и «Выбрать первую полосу» или с помощью сочетания клавиш. Используйте мышь, чтобы щелкнуть и удерживать в середине прямоугольника на первой полосе и перетащить его на следующую полосу.
Перейдите в «Анализ», «Гели» и «Выбрать следующую полосу». Повторите этот шаг для всех оставшихся полос. После того, как все полосы будут выделены и пронумерованы, перейдите в Analyze, Gels и Plot Lanes, чтобы нарисовать профильный участок каждой полосы.
Используйте инструмент выделения прямой линии, чтобы провести линию по основанию каждого пика, соответствующую каждой полосе, не пропуская фоновый шум. После того, как все пики с каждой полосы были закрыты, выберите инструмент палочки и нажмите внутри каждого пика. Измерения должны появляться в окне результатов для каждого выделенного пика.
Рассмотрим только пики 13S, 12S и 9S, соответствующие диапазонам 631, 493 и 156 пар оснований. Скопируйте данные об интенсивности для редактора электронных таблиц и суммируйте интенсивность из всех трех диапазонов для каждого образца, а затем рассчитайте процент для каждой изоформы относительно общего числа. График процентов каждой изоформы или различий в процентах относительно необработанных образцов.
Плазмиду, содержащую миниген из E1A, использовали для наблюдения влияния на альтернативное сплайсинг путем оценки доли мРНК из каждой полученной изоформы. Базальная экспрессия вариантов изоформ Е1А зависела от клеточной линии и времени экспрессии Е1А. Стабильная клеточная линия HEK 293, или сайт, содержащий рекомбиназу HEK 293, показала более высокую экспрессию 13S по сравнению с клетками HeLa, но показала аналогичные уровни изоформ 13S и 12S после 48 часов экспрессии E1A.
Клетки, подвергшиеся воздействию цисплатина, показали сдвиг в пяти простых S-S сплайсингах в пользу экспрессии 12S. Этот эффект наблюдался в HEK 293, стабильно выражающей пустой вектор Флага, а также изоформе одного из Nek4. Изменения в альтернативном сплайсингове после лечения паклитакселом были очень осторожными, но направления изменений были противоположны в клетках, экспрессирующих Флаг и Nek4.
При выполнении этого протокола важно использовать нетрансфектные и необратные элементы управления транскриптазой, чтобы избежать неправильной интерпретации с эндогенной экспрессией E1A, в основном при использовании клеток HEK 293. После получения положительных результатов может быть оценено альтернативное сплайсинг конкретных генов, связанных с химиотерапевтическим ответом. Когда наблюдается некоторый эффект, этот простой протокол может направить эти исследования на более последовательные пути, где белок играет роль, регулирующую альтернативное сплайсинг в ответе на химиотерапию, например.
