Многие аллергены связывают гидрофобные молекулы. Этот протокол позволяет полностью удалить и заменить эти лиганды, что позволяет нам систематически изучать их влияние на структуру и иммуногенность. Использование обратнофазного ВЭЖХ в сочетании с термическим отжигом имеет два преимущества.
Он удаляет эндогенные лиганды и помогает солюбилизировать лиганды, чтобы открыть недоступные в противном случае сайты связывания. Если мы сможем определить факторы, которые способствуют аллергенности, мы сможем разработать методы лечения, которые избегают этих факторов. Многие белки связывают липидные лиганды, которые сильно сохраняются и могут влиять как на структуру, так и на функцию.
Наш метод позволяет систематически изучать эти взаимодействия. Ограниченная растворимость и доступность многих липидных грузов может препятствовать процессу погрузки. Обязательно позаботьтесь об этом при подготовке этих лигандов и рассмотрите необходимость системных адаптаций.
Поскольку работа с гидрофобными и нерастворимыми лигандами является корректировкой для некоторых аллергологов и биохимиков, может быть полезно посмотреть, как выглядят образцы на разных этапах. После клонирования экспрессии и очистки применяют 12 миллилитров расщепленного Bla g 1 к центробежному фильтру с отсечкой молекулярной массы менее 10 килодалтон для многократных центрифугаций в поворотном роторе ковша до тех пор, пока общий объем не будет уменьшен до менее чем двух миллилитров. Загрузите полученный концентрат в систему ВЭЖХ 250 на 10 мм, оснащенную реверсивно-фазовой хроматографической колонкой C18, уравновешиваемой 97%-буфером A и 3%-ным буфером B.Elute Bla g 1 со скоростью потока от 1,5 до 4 миллилитров в минуту, как указано в таблице, используя флуоресцентное поглощение на 280 нанометров для мониторинга процесса элюирования.
Начиная примерно с 34-40 минут и буферная концентрация B выше 74%, собирают не более четырех миллилитров каждой фракции Bla g 1. Аликвот объединенную фракцию Bla g 1 в стеклянные пробирки. Накройте тюбики парафиновой пленкой и процедийте пленку двумя отверстиями.
Затем заморозьте образцы при минус 80 градусах Цельсия в течение одного часа и используйте лиофилизатор для сушки полученных делипидированных образцов белка. Для определения ожидаемого выхода Bla g 1 повторно суспендируют лиофилизированную делипидированную тестовую аликвоту в пяти миллилитрах буфера рефолдирования. Нагрейте смесь в 500-миллилитровом мучке, содержащем 250 миллилитров воды до 95 градусов Цельсия, на конфорке с перемешиванием и прерывистым вихрем.
Держите раствор при температуре 95 градусов в течение 30-60 минут, прежде чем дать водяной бане медленно уравновеситься до комнатной температуры. Когда раствор остынет, пропустите отожженную липидную смесь Bla g 1 через шприцевый фильтр 0,22 микрона для удаления твердых частиц и используйте новый центробежный фильтр с отсечкой 10 килодалтон для буферного обмена фильтрованного белка три раза на PBS для удаления любых остаточных свободных жирных кислот и органического растворителя. Затем оцените концентрацию белка с помощью стандартного анализа белка, чтобы определить ожидаемый выход для оставшихся аликвот Bla g 1.
Чтобы восстановить Apo-Bla g 1, повторно приостановите аликвоты Bla g 1 в пяти миллилитрах буфера переворачивания на аликвоту и отожгите образцы, как показано на продемонстрированной. Чтобы загрузить Bla g 1 фосфолипидами, добавьте 10 миллиграммов желаемого груза в стеклянную пробирку и растворите в хлороформе, а хлороформ испарите для получения липидной пленки. Затем добавьте PBS в трубку, чтобы получить конечную концентрацию фосфолипида 20 миллимоляров.
Нагревают фосфолипид выше температуры фазового перехода липидного груза для регидратировать липидную пленку и вихрь до тех пор, пока раствор не станет мутным. Затем добавьте фосфолипидный груз для получения 20-кратного молярного избытка лигандов по отношению к Bla g 1 на основе ожидаемого выхода. Может образоваться осадитель.
Вихрь для смешивания перед отжигом белка, как показано на демонстрации. Чтобы подтвердить удаление или погрузку груза с помощью ЯМР фосфора-31, используйте центробежный фильтр для концентрации образца до более чем 100 микромоляров, как показано на примере. Подготовьте образцы эталонных фосфолипидов известных концентраций в буфере PBS, как указано, и разбавьте концевую ссылку Bla g 1 до соотношения 1:1 с холатным буфером на общий объем около 600 микролитров.
Используйте широкополосный зонд для получения одномерных 31-фосфорных ЯМР-спектров коллатных солюбилизированных образцов Bla g 1 и эталонных стандартов фосфолипида и сравнивайте спектры ЯМР Bla g 1 31 фосфора с спектрами, полученными для эталонных образцов фосфолипида, чтобы подтвердить удаление эндогенно связанных лигандов и / или связывание желаемых лигандов на основе химических сдвигов видимых пиков, а затем сравнить пиковую интенсивность спектра Bla g 1 с эталонными стандартами фосфолипида, чтобы обеспечить подтверждение полной стехиометрии связывания. Используя аффинную хроматографию, рекомбинантный GST Bla g 1 может быть легко выделен до высокого уровня чистоты, производя выход от двух до четырех миллиграммов на литр клеточной культуры. Ночной инкубации с протеазой TEV при четырех градусах Цельсия достаточно, чтобы удалить метку GST, давая конечный продукт примерно в 24 килодалтонах.
Применение Bla g 1 к колонне C18 обратной фазы дает отличительный профиль элюирования, с двумя большими пиками при 50% буфере B, и вторым большим пиком при 75% буфере B.Фосфор-31 ЯМР спектры Apo-Bla g 1 не показывают обнаруживаемых фосфолипидов. Стандартная кривая может быть получена из ЯМР с использованием эталонных образцов известных концентраций DSPC. Сравнение интенсивности сигнала фосфора 31, полученного из DSPC Bla g 1, с этой стандартной кривой может быть использовано для получения стехиометрии связывания липидов на белок.
Круговые спектры дихроизма для Апо- и липидно-нагруженного Bla g 1 показывают минимумы 220 и 210 нанометров, что указывает на преимущественно альфа-спиральную структуру. Циркулярные анализы тепловой денатурации на основе дихроизма также показывают кооперационную потерю альфа-спиральной вторичной структуры, что указывает на складчатый глобулярный домен. Кроме того, анализ результирующих температур плавления показывает значительное увеличение при связывании лиганда nMix, что согласуется с Bla g 1, полученным из его естественного источника аллергена.
Успех этого протокола зависит от способности преодолевать как ограниченную растворимость гидрофобных лигандов, так и недоступный характер полость связывания Bla g 1. Эта процедура закладывает основу для иммунологических исследований, таких как анализы пролиферации Т-клеток, для оценки влияния липидных лигандов на сенсибилизацию и молекулярные механизмы, с помощью которых это происходит. Связав эту процедуру с дальнейшими биофизическими анализами, мы показали, что связывание гидрофобных лигандов повышает стабильность Bla g 1 с потенциальными последствиями для генерации эпитопов и аллергенности.
