אלרגנים רבים קושרים מולקולות הידרופוביות. פרוטוקול זה מאפשר הסרה והחלפה מלאה של ליגנדים אלה, ומאפשר לנו ללמוד את השפעתם על המבנה והאימונוגניות באופן שיטתי. לשימוש ב-HPLC הפוך, יחד עם חישול תרמי, יש שני יתרונות.
זה מסיר ליגנדים אנדוגניים, וזה עוזר לסכל ליגנדים כדי לפתוח אתרי קשירה שאינם נגישים אחרת. אם נוכל לקבוע את הגורמים התורמים לאלרגניות, אנו עשויים להיות מסוגלים לעצב טיפולים הנמנעים מגורמים אלה. חלבונים רבים קושרים ליגנדים של שומנים, אשר נשמרים בחוזקה ועשויים להשפיע הן על המבנה והן על התפקוד.
השיטה שלנו מאפשרת מחקר שיטתי של אינטראקציות אלה. המסיסות המוגבלת והנגישות של מטעני שומנים רבים עלולים לעכב את תהליך הטעינה. הקפד לטפל בעת הכנת ליגנדים אלה, ולשקול את הצורך בהתאמות ספציפיות למערכת.
כמו עבודה עם ליגנדים הידרופוביים בלתי מסיסים היא התאמה עבור כמה אלרגנים וביוכימאים, זה יכול להיות שימושי כדי לראות איך הדגימות נראות בשלבים שונים. לאחר שיבוט ביטוי וטיהור, להחיל 12 מיליליטר של Bla g בקע 1 ליחידת סינון צנטריפוגלי עם פחות מ 10 קילודלטון משקל מולקולרי ניתוק עבור צנטריפוגות מרובות רוטור דלי נדנדה עד נפח הכולל הופחת פחות משני מיליליטר. לטעון את התרכיז וכתוצאה מכך על 250 על ידי 10 מילימטר HPLC מערכת מצוידת C18 הפוך פאזה chromatography עמודה שווה עם 97%מאגר A ו 3%buffer B.Elute Bla g 1 בקצב זרימה 1.5 עד 4 מיליליטר לדקה, כפי שצוין בטבלה, באמצעות ספיגת פלואורסצנטיות ב 280 ננומטר כדי לפקח על תהליך elut.
החל בסביבות 34 עד 40 דקות וריכוז B חיץ מעל 74%לאסוף לא יותר מארבעה מיליליטר של כל Bla g 1 שבר. Aliquot Bla g בריכה 1 שבר לתוך מבחנות זכוכית. מכסים את הצינורות בסרט פרפין ומחוררים את הסרט בשני חורים.
לאחר מכן, להקפיא את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת ולהשתמש lyophilizer לייבש את דגימות החלבון de-השומנים וכתוצאה מכך. כדי לקבוע את התפוקה הצפויה Bla g 1, להשעות מחדש aliquot בדיקה lyophilized de-שומנים בחמישה מיליליטר של חיץ refolding. מחממים את התערובת ב 500 מיליליטר המכילה 250 מיליליטר של מים ל 95 מעלות צלזיוס על צלחת חמה עם ערבוב ומערבולת לסירוגין.
החזק את הפתרון ב 95 מעלות במשך 30 עד 60 דקות לפני מתן אמבט מים לאט לשוויון לטמפרטורת החדר. כאשר הפתרון התקרר, להעביר את תערובת השומנים Bla g 1 annealed דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרון כדי להסיר חומר חלקיקי, ולהשתמש במסנן צנטריפוגלי חדש עם 10 קילודלטון ניתוק כדי לאגור את החלבון מסונן שלוש פעמים לתוך PBS כדי להסיר כל חומצות שומן חופשיות שיורית ממס אורגני. לאחר מכן, להעריך את ריכוז החלבון באמצעות ניתוח חלבון סטנדרטי assay כדי לקבוע את התשואה הצפויה עבור aliquots Bla g הנותרים 1.
כדי לשקם את Apo-Bla g 1, להשעות מחדש את aliquots Bla g 1 בחמישה מיליליטר של מאגר refolding לכל aliquot, ו anneal הדגימות כפי שהוכח. כדי לטעון את Bla g 1 עם פוספוליפידים, להוסיף 10 מיליגרם של המטען הרצוי למבחנה זכוכית להתמוסס בכלורופורם, ולאדות את הכלורופורם כדי לייצר סרט שומנים. לאחר מכן, להוסיף PBS לצינור לייצר ריכוז פוספוליפיד הסופי של 20 מילימולאר.
מחממים את הפוספוליפיד מעל טמפרטורת המעבר הפאזה של מטען השומנים כדי לתחורר מחדש את סרט השומנים, ומערבולת עד שהפתרון הופך מעונן. לאחר מכן, להוסיף את המטען השומנים phospho לייצר עודף טוחן 20X של ליגנדים יחסית Bla g 1 מבוסס על התשואה הצפויה. משקע יכול להיווצר.
וורטקס לערבב לפני חישול החלבון כפי שהוכח. כדי לאשר הסרת מטען או טעינה על ידי זרחן-31 NMR, השתמש במסנן צנטריפוגלי כדי לרכז את המדגם ליותר מ -100 מיקרומולאר כפי שהוכח. הכן דגימות פוספוליפיד הפניה של ריכוזים ידועים במאגר PBS כפי שצוין, ולדלל את התייחסות קצה Bla g 1 ליחס 1:1 עם מאגר cholate לנפח כולל של כ 600 microliters.
השתמש בבדיקה בפס רחב כדי לרכוש חד מימדי, 31-זרחן NMR ספקטרום של דגימות Bla g 1 solubilized איסוף והתייחסות סטנדרטים פוספוליפידים, ולהשוות את ספקטרום Bla g 1 31 זרחן NMR לאלה שהושגו עבור דגימות התייחסות פוספוליפיד כדי לאשר את הסרת ליגנדים מאוגדים אנדוגני ו / או כריכה של ליגנדים הרצוי מבוסס על השינויים הכימיים של הפסגות הנראה, ולאחר מכן להשוות את עוצמת השיא של הספקטרום Bla g 1 לזה של תקני התייחסות פוספוליפיד כדי לאפשר אישור של stoichiome מחייב מלא. באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה, GST Bla g 1 רקומביננטי יכול להיות מבודד בקלות לרמה גבוהה של טוהר, לייצר תשואה של שניים עד ארבעה מיליגרם לליטר של תרבות התא. דגירה לילה עם פרוטאז TEV בארבע מעלות צלזיוס מספיק כדי להסיר את תג GST, מניב את המוצר הסופי בערך 24 קילודאלטון.
החלת Bla g 1 על עמודת C18 הפוכה מניבה פרופיל elution ייחודי, עם שתי פסגות גדולות ב 50%buffer B, ושיא גדול שני ב 75%חוצץ B.Phosphorus-31 ספקטרום NMR של Apo-Bla g 1 להראות לא פוספוליפידים לגילוי. עקומה סטנדרטית יכולה להיות מיוצרת מן NMR באמצעות דגימות הפניה של ריכוזי DSPC ידועים. השוואת עוצמת האות זרחן 31 המתקבל DSPC Bla g 1 נגד עקומה סטנדרטית זו ניתן להשתמש כדי להניב את stoichiometry מחייב של שומנים לחלבון.
ספקטרום dichroism מעגלי עבור Apo-ו השומנים טעון Bla g 1 להראות מינימה של 220 ו 210 ננומטר, המעיד על מבנה אלפא סלילי בעיקר. מבחני דה-נטורציה תרמיים מעגליים מבוססי דיכרואיזם מראים גם אובדן קואופרטיבי של מבנה משני אלפא-סלילי, המעיד על תחום כדורי מקופל. בנוסף, ניתוח של טמפרטורות ההיתוך וכתוצאה מכך מגלה עלייה משמעותית על מחייב nMix ligand, עולה בקנה אחד עם Bla g 1 המתקבל ממקור האלרגן הטבעי שלה.
ההצלחה של פרוטוקול זה מסתמכת על היכולת להתגבר הן על המסיסות המוגבלת של ליגנדים הידרופוביים, והן על האופי הבלתי נגיש של חלל הכריכה Bla g 1. הליך זה מניח את היסודות למחקרים אימונולוגיים, כגון מבחני התפשטות תאי T, כדי להעריך את ההשפעה של ליגנדים השומנים על רגישות ואת המנגנונים המולקולריים שדרכם זה קורה. צימוד הליך זה עם מבחנים ביופיזיים נוספים, הראינו כי קשירה של ליגנדים הידרופובי משפר את יציבות Bla g 1, עם השלכות פוטנציאליות במורד הזרם עבור ייצור אפיטופים ואלרגניות.
