Этот метод облегчает визуализацию встреч аддуктов ДНК, меченных реплисомным антигеном, и может быть распространен на взаимодействия любого белка со структурой ДНК или поражением, поддающимся иммунодетектированию. Этот метод может быть использован для оценки частот взаимодействия в отдельных клетках, а не в популяции, и позволяет визуализировать взаимодействие, зависящее от клеточного цикла, in situ без повреждения клеток. Продемонстрирует процедуру Ишани Маджумдар, постдок из лаборатории Сейдмана.
За день до эксперимента высевают 1,5 раза по 10 к пятой ячейке в два миллилитра среды на 35-миллиметровое стеклянное дно культуральной посуды, предварительно обработанной клеточным клеевым раствором. На следующий день замените надосадочную жидкость в каждой посуде средой с температурой 37 градусов по Цельсию. Пять микромоляров Dig TMP с добавлением 50-70% сливающихся клеточных культур и верните пластины в инкубатор клеточных культур на 30 минут, чтобы позволить Dig TMP уравновеситься. Пока клетки инкубируются, предварительно разогрейте УФ-бокс до 37 градусов по Цельсию.
В конце уравновешивания перенесите планшеты в предварительно разогретый ящик, чтобы подвергнуть клетки пятиминутной дозе света UVA в три джоуля на квадратный сантиметр, и замените надосадочные жидкости двумя миллилитрами свежей предварительно подогретой питательной среды, прежде чем возвращать планшеты в инкубатор клеточных культур в течение одного часа. По окончании инкубации аккуратно промойте культуры PBS и зафиксируйте ячейки одним миллилитром 0,1%формальдегида в PBS на пять минут при комнатной температуре. В конце инкубации промойте клетки один раз PBS, а затем обработайте клетки два раза 80 микролитрами буфера для экстракции цитоскелета с добавлением РНКазы в течение пяти минут при комнатной температуре на каждую обработку для удаления цитоплазмы.
После второй инкубации промойте клетки двумя миллилитрами PBS три раза, прежде чем зафиксировать клетки одним миллилитром 4%-ного формальдегида в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре. После второй фиксации трижды промойте клетки PBS, как показано, с последующей обработкой одним миллилитром холодного 100% метанола в течение 20 минут при температуре минус 20 градусов по Цельсию. В конце инкубации промойте клетки три раза в двух миллилитрах PBS с последующей 10-минутной инкубацией в 80 микролитрах пятимиллимолярного Triton X-100 при четырех градусах Цельсия.
В конце инкубации обработайте клетки 100 микролитрами пяти миллимолярных ЭДТА в PBS, дополненных одним микролитром 100 миллиграмм на миллилитр РНКазы А в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. В конце инкубации промойте клетки три раза в PBS, прежде чем хранить их в 5% бычьей сыворотке альбумина и 10% ослиной сыворотке в PBS во влажной камере на ночь при четырех градусах Цельсия. Чтобы выполнить анализ бесконтактного лигирования, добавьте 40 микролитров раствора первичного антитела, представляющего интерес, в центр каждой пластины и инкубируйте планшеты во влажной камере в течение одного часа при 37 градусах Цельсия.
В конце инкубации трижды промойте клетки двумя миллилитрами PBST, а затем добавьте 40 микролитров свежеприготовленного раствора зонда PLA в каждую чашку для часовой инкубации в инкубаторе клеточных культур. По окончании инкубации промойте ячейки тремя 10-минутными промывками в двух миллилитрах буфера А на наклонной платформе при комнатной температуре. После последней стирки добавьте 40 микролитров свежеприготовленной смеси для лигирования в каждую тарелку для 30-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия, а затем трех двухминутных промывок в буфере А на опрокидывающейся платформе.
После последней промывки добавьте в каждую пластину по 40 микролитров свежеприготовленного амплификационного раствора для 100-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия во влажной камере. По окончании инкубации шесть раз промойте ячейки свежим буфером B в течение 10 минут на опрокидывающейся платформе. После последней промывки буфера B промойте клетки один раз 0,01x буфером B в течение одной минуты при комнатной температуре, прежде чем маркировать соответствующими вторичными антителами во влажной камере в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия.
В конце инкубации промойте образцы тремя 10-минутными промывками на наклонной платформе в PBST при комнатной температуре, прежде чем устанавливать их в монтажную среду с добавлением DAPI. В течение четырех дней после установки отобразите не менее 100 наблюдений за образцом или состоянием клеток на эпифлуоресцентном или конфокальном микроскопе, используя одни и те же настройки экспозиции как для экспериментальных, так и для контрольных образцов. Тег Dig может быть визуализирован с помощью иммунофлуоресценции, чтобы выявить наличие межцепочечных поперечных связей по всему ядру.
Чтобы визуализировать взаимодействие ответов с межцепочечными поперечными ссылками, PLA может быть применен для визуализации частоты ассоциации MCM5 и тега Dig через час после введения межцепочечной поперечной связи. Поскольку репликационный стресс активирует ATR-киназу, PLA между pMCM двумя серином 108 и тегом Dig также положительный. Результаты PLA из отдельных ядер могут быть представлены в виде трехмерной реконструкции, позволяющей визуализировать ответные межцепочечные сшивки по всему ядру.
Анализ репликационной вилки показывает, что встречи межцепочечных сшивок демонстрируют неожиданное явление перезапуска репликации, поскольку белки комплекса GINS не проявляют сигнал PLA с межцепочечными сшивками. Напротив, анализ с CD 45 положительный, что указывает на то, что другой блокирующий белок сохраняется. Когда клетки инкубируются с ингибитором ATR, перезапуск полностью подавляется, и PLA GINS Dig сильно положительный.
Обработка CSK+R необходима для снижения фонового сигнала. Обязательно покройте пластины клеем для ячеек и добавьте к ним приставку 0,1% FA, иначе ячейки отклеятся от пластины.
