Эта модель гемодинамической петли позволяет исследователям проверить несовместимость в пробирке гемо сосудистых устройств, таких как перфузионые трубки или стенты. на стандартизированных условиях. Таким образом, этот метод не оказывает никакого влияния на кровь с помощью механической силы и тем самым избежать вводящих в заблуждение результатов внутренней активации компонентов крови.
Перед попыткой эксперимента необходимо практиковать правильную механическую сборку деталей, идеальную конструкцию системы замыкания петли и медленную загрузку крови в петли. Для подготовки петли сборки, использовать резак трубки сократить 250 сантиметров в длину, пять миллиметров внутреннего диаметра куски труб на плоской поверхности. И подключите открытые окончания труб в короткий кусок силиконовой трубки установки внешнего диаметра следственной трубки для создания формы петли.
Тщательно затяните запирающиеся винты разъема натяжения и отрегулируйте силу закрытия так, чтобы между двумя изгибами не осталось зазора. Если замок винт полностью ужесточены и напряжение поликарбонатной полосы кажется слишком низким, чтобы закрыть разрыв между двумя изгибами, открыть систему блокировки и сократить несколько миллиметров натяжения полосы. Чтобы подготовить сборку стентового цикла, откройте две петли и вынюхив трубку из системы натяжения.
Затем вставьте стент в середину трубки по указанию производителя. Когда соответствующее количество петель для эксперимента были созданы безопасные петли в петле колыбели вращения блока, за пределами 37 градусов водяной бани и прикрепить петлю колыбели к блоку вращения внутри водяной бани. Затем заполните один 10 миллилитров шприц на каждые две петли крови, которые будут собраны с 150 микролитров или свежеприготовленный раствор гепарина фонда и использовать 21 калибровочных бабочки, чтобы аккуратно собирать кровь в шприцы, заботясь, чтобы избежать гомолиза или активации клеток из-за чрезмерного вакуума.
Когда вся кровь была собрана передачи крови в стакан и использовать пять миллилитров серологических пипетки, чтобы аккуратно смешать кровь и гепарин. Когда однородный раствор был получен с кончиком пипетки не полностью вставляется в трубку, тщательно, заполнить каждую петлю с пятью миллилитров крови. Закройте каждый цикл после того, как он был заполнен и подтвердить, что петля, натяжение полосы и стойки должным образом обеспечены.
Затем поверните петли в течение трех часов при 30 оборотов в минуту. В конце вращения, позвольте петли стоять в стойке в течение двух минут, чтобы кровь накапливается на петле днища, прежде чем тщательно открыть разъемы и потянув кровь из дубликатов в отдельных 10 миллилитров стеклянные стаканы. Когда вся кровь была собрана промыть каждую трубку с 10 миллилитров PBS и использовать скальпель тщательно сократить один сантиметр образца от конца каждой трубки.
Инкубировать образцы на ночь в 2%glutaraldehyde при четырех градусах по Цельсию, а затем 15 минут инкубации и 1%osmium тетроксида при комнатной температуре. В конце инкубации осмия тетроксида обезвоживает образцы в восходящей серии этанола в течение 20 минут на концентрацию, а затем 30 минут обезвоживания в 100% этанола. В конце 100%-ной инкубации этанола, пусть образцы высыхают на ночь при комнатной температуре перед визуализацией образцов путем сканирования электронной микроскопии при ускорении напряжения в пять киловольт, с помощью рентгеновского микро-КТ сканера.
Для цитометрического анализа кровотока. Передача 100 микролитров крови из каждого образца в каждый из девяти пяти миллилитров FACS труб и исправить образцы с добавлением 100 микролитров 4%power формальдегида на трубку в течение 15 минут при комнатной температуре защищены от света. После мытья, повторно приостановить каждую гранулу в один миллилитр красного буфера лиза крови на трубку, в течение пяти минут инкубации при комнатной температуре, защищены от света.
В конце инкубации, мыть образцы центрифугации в один миллилитр PBS на трубку и поместить образцы без их supernatants на льду. Для подготовки одного пятна компенсации шарики добавить четыре капли положительных и четыре капли отрицательных шариков в отдельных один миллилитр объемов буфера FACS, и вихрь решения для получения однородной подвески шарика. Добавьте 100 микролитров каждого раствора к каждой из четырех или пяти миллилитров facS труб помечены как указано и мыть бисер с одним миллилитром буфера FACS на трубку.
Далее добавьте 100 микролитров соответствующего вихревого коктейля антител к каждой экспериментальной и флуоресценции минус одна трубка с нежным смешиванием. В течение 30 минут инкубации при комнатной температуре, защищенной от света. В конце инкубации промойте образцы одним миллилитром свежего буфера FACS на образец и заново потух в 250 микролитров буфера FACS на трубку.
Перед анализом бисера на образцах клеток по цитометрии потока, в соответствии со стандартными протоколами. Распределение клеток крови можно визуализировать по всей поверхности сращивания двух bloops микро КТ и сканирование электронного микроскопа изображения в то время как сгустки не наблюдаются в закрытых петлях без пробелов. Анализ всего количества клеток крови, не показывает значительных различий в цифрах эритроцитов между любым из проверенных условий, тромбоцитов и лейкоцитов номера однако, резко снижается в группе латексной петли и свободные номера гемоглобина резко увеличилось, что свидетельствует о очень плохой биосовместимости латекса.
В то время как все проверенные сосудистые устройства вызывают повышенную активацию системы коагуляции и комплимент компонента. Гепарин покрытием ПВХ петли демонстрируют тенденцию к снижению уровня обоих типов активаций по сравнению с полимерным покрытием, ПВХ петли. Латексные петли демонстрируют самые высокие уровни TNF IL-6 и PMN elastase, подчеркивая мощную активацию лейкоцитов латексом.
CD41 положительные тромбоциты, восстановленные из латексных трубок, демонстрируют чрезвычайно высокую медианную интенсивность флуоресценции для CD62P, в то время как интегрированное выражение резко снижается на гранулоцитах и лимфоцитах. Интерес, интегральные уровни выше в моноцитах из латексных трубок, предлагая моноцитов активированных взаимодействий тромбоцитов. Действительно окрашивание для моноцитов тромбоцитов агрегатов показывает повышенную тенденцию к агрегации в латексных и стентовых петлях.
Несмотря на снижение частоты моноцитов в латексных петлях. Чтобы избежать активации внутреннего компонента крови, важно обеспечить надлежащее закрытие петли и обращаться с кровью с осторожностью. Таким образом, после этой процедуры, можно проанализировать взаимодействие между аллогенными белками или TRUCKs и компонентов крови, которые используются в воспалении или фармацевтических исследований.
