Эта модель in Vitro Disease может быть использована для изучения взаимодействия всей крови и производных клеток пациента, в частности эндотелиальных, для оценки тромбогенности и эффективности антикоагулянтных агентов. Это эндотелий клетки могут быть использованы при различных обстоятельствах и могут быть изменены путем введения на заказ микрофлюиды или путем корректировки параметров кровотока. Кроме того, эта модель может быть использована для изучения динамики тромбов в воспалительных условиях, или для оценки воздействия антикоагулянтной и антитромбоцитатерапии.
В конечном счете, эти подходы могут быть использованы в методе персонализированной медицины. После получения хирургического образца легочной артерии человека, пальто высокой сродства клеток связывания 60 миллилитров клеточной культуры блюдо с двумя миллилитров из пяти микрограммов на миллилитр фиборонектина и инкубировать блюдо при 37 градусов по Цельсию, по крайней мере 15 минут. В конце инкубации используйте стерильные типсы в шкафу ламинарного потока в стерильных условиях, чтобы перенести ткань в чашку Петри PBS.
Если ткань все еще находится в кольце, разрежьте артерию ножницами, заботясь о том, чтобы не касаться внутреннего слоя сосуда, так как эндотелий легко повреждается и удаляется. После удаления фибронектина, добавить четыре миллилитров полной эндотелиальной клеточной среды к блюду и использовать типсы для передачи образца ткани в среду, использовать скальпель, чтобы тщательно соскребать внутренний слой сосуда в среду, заботясь, чтобы избежать накопления липидов, которые наблюдаются в стенке сосуда. После того, как клетки были собраны, поместите пластину в инкубатор клеточной культуры.
Если фибробласты загрязняют культуру, используйте магнитное разделение клеток сродства для CD144, в соответствии с инструкциями производителя, чтобы очистить клетки. Как правило, культура определяется как чистая, когда цитометрия потока обнаруживает 10% или меньше загрязняющих клеток. Когда достаточное количество эндотелиальных клеток были получены для экспериментального использования, первичные эндотелиальные клетки могут быть охарактеризованы на наличие эндотелиальных клеток конкретных маркеров и отсутствие гладких мышечных и эпителиальных маркеров клеток.
Для подготовки камеры потока код один канал из шести слайдов потока хорошо с 30 микролитров 0,1% желатина и инкубировать этот слайд, по крайней мере 15 минут при 37 градусов по Цельсию. В дополнение к коммерческим камерам потока, изготовленные на заказ камеры потока с определенными размерами могут быть использованы для изучения влияния сосудистой геометрии на динамику сгустка. В то время как слайд инкубации, собирать клетки из confluent легочной артерии эндотелиальной клеточной культуры с ЭДТА и трипсина и осадка, что клетки центрифугации, повторно приостановить гранулы в 600 микролитров полного эндотелиальной клеточной среды и силой, но осторожно, добавить 100 микролитров клеток в каждом канале, добавить дополнительные 50 микролитров полной эндотелиальной клетки среды , чтобы обеспечить достаточную среду для ночной инкубации при 37 градусах По Цельсию и 5%углекислом газе, измените среду на следующий день, чтобы смыть несыханные клетки.
После шести дней в культуре, клетки должны были образовать стабильный слияние монослой. На седьмой день эндотелиальной клеточной культуры легочной артерии, приобрести венозные образцы крови у испытуемых, которые не получают антикоагуляции лечения в 109 мононатрия цитрат антикоагулянтных труб и передачи крови в 50 миллилитровую трубку. Кровь может содержать вирусы и другие инфекционные агенты.
Поэтому важно всегда носить перчатки и следовать указаниям по безопасности для работы с человеческим материалом. Флуоресцентно помечены клетки крови с 1 до 10000 концентрации Calcein AM Красный и 50 микрограмм на миллилитр и добавить Alexa 488 фибриноген, а затем инкубировать кровь при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное поглощение. За 30 минут до перфузии обработать эндотелиальные клетки легочной артерии 100 микролитров одного микромоляного гистамина в эндотелиальной клеточной среде и 1%фетальной сыворотки крупного рогатого скота без каких-либо других добавок.
И использовать 20 миллилитров шприц заполнены стиральный буфер для полоскания трубки системы потока, загрузить от трети до 20 миллилитров шприц с двумя миллилитров мыть буфера и загрузить шприц на шприц насоса. Используйте второй 20 миллилитровый шприц, чтобы заполнить трубки потока с хиппи плюс буфер, содержащий 1%бычий альбумин сыворотки и использовать локоть форму Лаура разъем тщательно подключить трубки к микро слайд, подключить розетку слайда к шприцу, ремонт от микроскопии путем размещения ячейки, содержащей слайд на сцену и сборки установки для эксперимента , настроить микроскоп и установить параметры для изображения. Перекалибрование решительной крови.
И это счастливый соавтор коагуляции, кроме того, старайтесь избегать образования пузырьков воздуха, потому что это будет поврежденный слой эндотелиальных клеток и влиять на ваши результаты. Непосредственно перед перфузией разбавить кровь в два раза буфером перекалибровки и поместить входную трубку микроскользя в трубку крови, нажмите на насос шприца. Как только кровь начинает течь над эндотелием, нажмите на микроскоп, чтобы получить изображения с помощью заранее выбранных активных каналов и области процентных позиций, каждые 15 секунд в течение пяти минут.
В конце анализа, остановить запись и шприц насоса и очистить должным образом. Маркировка тромбоцитов с Calcein AM Red и добавление Alexa 488 спряженного фибриногена, позволяет исследование образования тромбоцитов и волокна и осаждения. При не стимулированных условиях нет связывания тромбоцитов или фибрина с эндотелием.
Стимуляция с гистамином приводит к немедленному увеличению адгезии тромбоцитов, которая достигает плато через 2,5 минуты, в этот момент времени тромбоциты начинают выделяет факторы аутокрина, которые вызывают агрегацию тромбоцитов и расщепление фибриногена до фибрина, в результате чего клетчатка и осаждение в течение трех минут и формирование стабильного агрегата с тромбоцитами через четыре минуты. Лечение прямым антикоагулянтом, подавляет образование тромбов и адгезии тромбоцитов по сравнению с необработанной кровью. Иммунофлюоресцентный анализ эндотелиальных взаимодействий тромбоцитов легочной артерии после пяти минут перфузии показывает поддержание эндотелиальной клетки, контактов клеток, что подтверждается окрашиванием сосудистой эндотелиальной кадгерин, указывая на то, что сгустки крови образуются на эндотелиальных слоях модели, а не на основной матрице между эндотелиальными зазорами.
эндотелиальные клетки пупочной вены человека демонстрируют меньше адгезии тромбоцитов и фибринового осаждения по сравнению с эндотелием легочной артерии. Примечательно, что больные первичной легочной артерии эндотелиальных клеток от хронических тромбоэмболических легочной гипертензии пациентов, проявляют повышенную адгезию тромбоцитов и более фибринового осаждения по сравнению со здоровыми клетками. Тромбогенность эндотелия зависит от нескольких факторов, таких как происхождение сосудистой кровати или части биологического фона.
Используя этот протокол, внутренние дисфункции в сосудистых и компонентов крови, а также эффективность антикоагулятивной терапии могут быть проверены в различных фазах тромбоза гемостаза. Этот протокол может быть использован для понимания взаимодействия крови и Тео, при различных тромбоэмболических заболеваниях с конечным потенциалом для прогнозирования конкретных реакций пациента на антикоагуляционную терапию.
