Эффективно вызывая точечные мутации с помощью редактора баз цитозина, опосредованного CRISPR, можно определить функциональность вариантов BRCA1, что важно для профилактики и диагностики заболеваний. Преимущество этого метода заключается в том, что он непосредственно мутирует эндогенно выраженный BRCA1, который преодолевает ограничение функциональной оценки с помощью экзогенно выраженного BRCA1. Выявление потери функциональных мутаций BRCA1 может быть использовано для прогнозирования вероятность развития рака, связанного с мутациями BRCA1, такими как рак молочной железы, яичников, простаты и поджелудочной железы.
Он также может быть использован для поиска потенциальных целей наркотиков путем поиска основных генов, жизнеспособность которых снижается за счет функционального истощения. Для начала, получить последовательность генома BRCA1 от GenBank в NCBI и поиск 20 базовых пар целевых сайтов с протопространственной смежных мотив последовательности, NGGNCCN, вокруг мутации интереса. Мутация интереса должна быть расположена в пределах четырех-восьми нуклеотидов в PAM-дистальной конце руководства РНК целевых последовательностей.
Закажите два бесплатных олигонуклеотидов на направляющий РНК. Для форвардных олигонуклеотидов добавьте CACCG к 5'концу направляющий последовательности и к обратным олигонуклеотидам добавьте AAC к 5'end и C к 3'end. После получения олигонуклеотидов, повторно использовать их в дистиллированной воде до конечной концентрации 100 микромолей.
Смешайте два бесплатных олигонуклеотидов до конечной концентрации 10 микромолеров с буфером перевязки T4 и нагревайте их до 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут, затем охладите их до комнатной температуры для анеальтирования. Дайджест pRG2 с использованием фермента ограничения Bsa1 в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию, затем запустите переваренный продукт на гель 1%agarose и очистите соответствующую по размеру полосу. Ligate annealed олигонуклеотид дуплекс вектор ДНК с помощью закупленной лигозы ДНК в соответствии с протоколом производителя и превратить их в DH5-альфа компетентных клеток.
Добавьте трансформанты в агарную пластину, содержащую 100 микрограммов на миллилитр ампициллина, и инкубировать пластину на ночь при 37 градусах по Цельсию. Очистить ДНК плазмы от нескольких трансформантов и проанализировать их руководство РНК последовательности Сэнгер секвенирования с грунтовки, что премьер на U6 промоутер. Семя пять раз от 10 до пятого HAP1-BE3 клеток на колодец в 24-хорошо пластин за день до трансфекции и культуры их достичь 70 до 80% слияния для трансфекции.
Transfect BRCA1 ориентируется на РНК с использованием приобретенных трансфектных реагентов в соответствии с протоколом производителя. Используйте один микрограмм BRCA1 ориентации руководство РНК, чтобы побудить CG к преобразованию TA на BRCA1 целевых сайтов затем инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию и субкультуры каждые три-четыре дня. Урожай ячейки гранулы три, 10 и 24 дней после трансфекции для анализа эффективности базового редактирования.
Извлекайте геномную ДНК с помощью комплекта геномной очистки ДНК. Разработка первых праймеров ПЦР для усиления целевых объектов BRCA1. Несмотря на отсутствие ограничений на размер первого продукта ПЦР, размер продукта менее одной килобазы рекомендуется эффективно усиливать определенный регион.
Дизайн второй ПЦР грунтовки, расположенные внутри первого продукта ПЦР, с учетом размера ампликона в соответствии с NGS читать длины. Для того, чтобы прикрепить необходимые последовательности для анализа NGS, добавьте дополнительные последовательности к 5'ends второй праймеров ПЦР. Усиление целевых участков BRCA1 на геномной ДНК, полученной из трех точек времени с использованием полимеразы высокой точности.
Для первой реакции ПЦР используйте 100 нанограммов геномной ДНК для усиления в течение 15 циклов. Для второй реакции ПЦР используйте один микролитр первого продукта ПЦР для усиления в течение 20 циклов. Запустите пять микролитров второго продукта ПЦР на 2%agarose гель и подтвердить размер.
Затем приложите основные последовательности для анализа NGS, усиливая второй продукт ПЦР с помощью грунтовок, перечисленных в текстовой рукописи. Усильте каждый образец с помощью различных наборов грунтовок. Используйте один микролитр второго продукта ПЦР для до 30 циклов усиления с полимеразой высокой точности.
Запустите пять микролитров продукта ПЦР на 2%agarose гель, чтобы подтвердить размер и очистить amplicon с помощью коммерческого комплекта очистки ПЦР. Смешайте каждый образец в равных количествах для создания библиотеки NGS. Количественная оценка библиотеки NGS с помощью спектрофотометра и разбавить его до концентрации одного наномоляра с помощью буфера повторного успенения или 10 миллимоляров Tris-HCl при рН 8.5.
Приготовьте 100 микролитров библиотеки, разбавленных до соответствующей концентрации нагрузки. В качестве управления фисх сочетался PhiX с разбавленным образцом. Загрузите библиотеку на картридж и запустите NGS в соответствии с протоколом производителя.
Получите более 10 000 считываний на целевой ампликон для углубленного анализа эффективности базового редактирования. Этот протокол использовался для проведения функциональной оценки эндогенных вариантов BRCA1, генерируемых редакторами базы цитозинов на основе CRISPR. CAS-9 и направляющий РНК были трансфицированы в клеточные линии HAP1, чтобы нарушить BRCA1, и были проанализированы частоты мутаций.
Частоты мутаций значительно снизились с течением времени в клеточных линиях HAP1, что указывает на то, что BRCA1 является важным геном для жизнеспособности клеток в этих клетках. Чтобы исследовать, влияет ли CG на заменяемые варианты на функцию BRCA1, плазмиды ДНК и руководство по кодированию РНК, которые могли бы вызвать каждую мутацию, были трансфицированы, чтобы иметь клеточные линии HAP1-BE3. И были проанализированы частоты замещения.
Относительная замена частот 3598C к T, патогенный вариант, который вызывает нонсенс мутации, резко снизилась. В то время как те из 4527C к T, доброкачественный вариант, который вызывает глупость мутации, остались аналогичными со временем. Было установлено, что частоты замещения нуклеотидов этих трех вариантов уменьшились в зависимости от времени образом.
Поскольку необходимо получить высокую начальную частоту мутаций, чтобы четко распознать изменение жизнеспособности клеток с течением даты, приоритетом является создание оптимизированных условий трансфекции. Эта процедура может быть применена для проверки других неизвестных генетических вариантов, таких как BRCA VUS. Это может дать ключ к патогенности пациентов полученных неизвестных вариантов и их лечения.
