Этот протокол облегчает подготовку и администрирование вирусного и фагового коктейля против псевдомонас аэругиноза в эмбрионах зебры. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет in vivo оценки эффективности фагов в противодействии бактериальной инфекции. Фаг коктейль эффективен как в диком типе и муковисцидоз зебры модели.
Открытие возможности применения фаговой терапии к бактериальным инфекциям у больных муковисцидозом. Фаг-терапия также может быть применена для противодействия конкретным бактериальным инфекциям в других модельных системах. Подготовить фаговой запас к эксперименту.
Добавить 1,25 раза 10 до седьмого фагов в OD 600 из 0,05 P.aeruginosa культуры к множественности инфекции один раз от 10 до отрицательного три и инкубировать культуру в течение трех-четырех часов с встряхивания до OD 600 падает до 0,1 до 0,3. В конце инкубации инкубировать лизат с одним микрограммом на миллилитр ДНК и РНКзы в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию. И гранулировать клетки центрифугой.
В конце центрифугации фильтр супернатант через 0,8 микрометра поры диаметром и добавить 58 граммов на литр хлорида натрия и 105 граммов на литр PEG 6000. Инкубировать раствор при четырех градусах по Цельсию за одну ночь. На следующее утро, осадки фага центрифугации.
В конце центрофугации удалить супернатант и тщательно растворить фаг гранулы в 15 миллилитров Tris хлорида натрия буфера. Чтобы очистить фаги градиентом плотности хлорида цезия, сначала расслоить два миллилитра из четырех различных растворов хлорида цезия в полиалломерных ультрацентрифугных трубках для SW 41 Rotor и добавить 3,5 миллилитров фаговой суспензии к каждой трубке. Хлорид цезия токсичен.
Всегда при принятии надлежащих процедур безопасности при обработке и отбрасывая это соединение. Когда все трубы были загружены, поместите трубки в ротор, заботясь о том, чтобы трубы были сбалансированы. И центрифугировать образцы в течение двух часов при 100 000 раз г и четыре градуса по Цельсию.
В конце центрифуги используйте шприц с иглой 19 калибра, чтобы аспирировать белый слой между D равен 1,5, а D равен 1,4 области плотности. И перенесите подвески в новые полиалломеры размером с SW 60. Центрифуга подвески, по крайней мере 16 часов при 150000 раз г и четыре градуса по Цельсию.
И перенесите видимые полосы в диализные трубки с отрезанием Далтона на 6000. Затем диализа собранные образцы два раза против 500 миллилитров воды в течение 20 минут на диализ и на ночь против 500 миллилитров tris хлоридного хлорида буфера. На следующее утро, фильтр в результате фаг запас с 0,22 микрометр поры фильтра и хранить акции на четыре градуса по Цельсию.
В день микро-инъекции разбавить два одного микромолара морфолиноса фондовых растворов в стерильной воде до окончательной концентрации 0,25 пикомоляр на эмбрион, чтобы получить пять микролитер морфолино инъекционный раствор. И добавить 0,5 микролитров фенола красный к каждому раствору. Далее используйте 20 микролитер микропипет с тонкой гель загрузки отзыв для загрузки микро инъекции иглы со всем объемом морфолино смешанного раствора и обеспечить иглу микро манипулятор подключен к стенду под стерео микроскопом.
Затем с одной или двумя клетками, эмбрионы рыб зебры расположены на стеклянной горке, помещенной в пределах 96 миллиметров в диаметре чашки Петри, проникают в хорион и желток с микроинкурсной иглой и вводят два нанолитров смеси морфлино в эмбрион. В 26 часов после оплодотворения загрузите микроинъемку иглы примерно пятью микролитровами инокулы P.aeruginosa и вставьте иглу dorsally к отправной точке протока Кювье, при котором проток начинает распространяться по желтковому мешку. Ввимите в эмбрион от одного до трех нанолитров инокулятора PAO1, чтобы убедиться, что объем расширяется непосредственно в пределах протока и попадает в кровообращение.
После инъекции перенесите эмбрион в одно из двух новых блюд Петри, содержащих свежие E3 среднего дополняется фенилтируреа в течение 30 минут или трех часов инкубации при 28 градусов по Цельсию. Затем загрузите микроинъемную иглу примерно пятью микролитровами фагового коктейля и зафиксните иглу к микроинжектору. Затем ввините от одного до трех нанолитров фагового коктейля в проток Кювье каждого эмбриона, ранее введенного с бактериями, и поместите эмбрионы в одну из двух новых чашек Петри, содержащих свежие E3 средние, дополненные фенилтиреей при 28 градусах по Цельсию.
В течение четырех часов после заражения используйте пластиковую пипету для переноса обезболивающего эмбриона в стеклянную нижнюю тарелку. И заполнить блюдо с теплой низкой точки плавления агарозы раствора. Когда агароза холодная, аккуратно заполните блюдо средой Е3, дополненной анестетической раствором.
Поместите блюдо под стерео микроскоп и используйте наконечник пипетки, чтобы распоидать эмбрион в нужной ориентации. Затем поместите блюдо под флуоресцентный стерео микроскоп с флуоресцентным фильтром для положительных бактерий GFP на срок до 18 часов после заражения и изображение эмбриона для прогрессирования экспрессии GFP в девять, 14 и 18 часов после заражения. Чтобы определить бактериальную нагрузку на восемь часов после заражения, перенесите 15 анестезированной микро-инъекционных эмбрионов в 1,5 миллилитр центрифуг трубки и заменить обезболивающее решение с 300 микролитров 1%Triton X-100 в PBS.
Пройдите иглы через стерильную 27 калибровочных игл инсулинового шприца по крайней мере 15 раз, чтобы гомогенизировать эмбрионы. И подготовить серийные разбавления гомогената путем передачи 100 микролитров полученной смеси в 900 микролитров стерильных PBS на разбавление. Чтобы выбрать для естественно ампициллина устойчивый штамм P.aeruginosa, пластины 10 микролитров разбавления на LB агар дополняется ампициллин и инкубировать их на ночь при 37 градусов по Цельсию.
На следующий день подсчитайте количество колоний. Разрешить расчет общего количества колоний, образующих единицы, и среднего количества колоний, образующих единицы на зараженный эмбрион. Для оценки летальности инфекции P.aeruginosa оценка инъекционных эмбрионов в 20 часов после заражения под стерео микроскопом, подсчитав количество мертвых белых непрозрачных эмбрионов.
Затем рассчитать половину максимальной смертельной концентрации 50 дозы P.aeruginosa, что привело к смерти 50% инъекционных эмбрионов в 20 часов после заражения. Для проверки фенотипа муковисцидоза можно оценить нарушение положения внутренних органов, таких как печень сердца и поджелудочная железа. Бактериальная нагрузка уменьшается с помощью фагоевой терапии эмбрионов муковисцидоза, инфицированных P.Aeruginosa.
В 48 часов после оплодотворения муковисцидоз эмбрионов, инфицированных GFP положительные бактерии P.Aeroginosa 30 колоний формирования единиц на дозу эмбриона демонстрирует 50% летальности в 20 часов после заражения. Фаг-терапия одинаково эффективна в 20 часов после инфицирования при доставке через 30 минут или семь часов после бактериальной инъекции. Здесь показан муковисцидоз и GFP положительный P.Aeruginosa инъекционных эмбрионов в четыре, девять, 14 и 18 часов после заражения показано.
В отличие от муковисцидоза плюс P.Aeruginosa плюс фаг вводили эмбрион демонстрирует снижение флуоресценции из-за фагов действий против бактерий. Воспалительные реакции, порожденные инфекцией P.aeruginosa в муковисцидоз эмбрионов значительно увеличивается, как показано на экспрессии провоспалительных цитокинов, TNF альфа и интерлейкин 1 бета после инъекции P.aeruginosa по сравнению с контролем вводили зебры. Выражение обоих воспалительных цитокинов уменьшается в фаг коктейль совместно вводили животных однако.
Фаге должны быть тщательно очищены, чтобы удалить любой загрязняющий эндотоксин, который может быть сохранен во время подготовки. Фаг препараты могут быть проанализированы с помощью электронной микроскопии для оценки морфологии вириона. Было бы интересно проверить, является ли инфекция у пациентов с человеком бактериями, кроме pseudomonas aeruginosa можно вылечить с фаговой терапии в муковисцидоз зебры модели.
