Наш метод использует выбор диапазона хоста и флуоресцентные маркеры для эффективного и бесшовного генерации рекомбинантного вируса вакцины в различных типах клеток. Этот метод сочетает в себе скорость гомологичной рекомбинации с бескарастной природой переходного доминирующего отбора. Кроме того, мы размехаем выбор диапазона, чтобы исключить возможность химически индуцированных изменений.
Этот метод также может быть использован для модификации вируса вакцины или других поксвирусов для выражения иностранных генов, например, для создания вакцин. Если вы выполняете этот протокол только с выбором флуоресценции, вы должны убедиться, что вы скрининга достаточно вирусов для обнаружения относительно редких рекомбинантов без избирательного давления PKR. Этот метод опирается на увеличение и потерю флуоресцентных маркеров для успешного выбора вирусов, которые приобрели рекомбинации кассеты и для обнаружения вирусов, которые имеют без шрамов рекомбинации.
Для генерации вектора рекомбинации сначала добавьте 17 микролитров свободной воды DNase, 1,2 микролитров каждой грунтовки, пять микролитров буфера реакции ПЦР, шаблон ДНК и 0,5 микролитров полимеразы ДНК в одну трубку ПЦР на ампликон. Добавьте дополнительную бесплатную воду DNase, чтобы довести окончательный объем в каждой трубке до 50 микролитров. И поместите трубки в термоциклер.
Растопить ДНК на 98 градусов по Цельсию в течение 30 секунд, прежде чем использовать 25 раундов трехшагового протокола ПЦР, как указано. Для визуализации продуктов усиления на 1%agarose гель, добавить 10 микролитров каждого продукта ДНК и 2 микролитров погрузочного буфера для каждой хорошо. Вы запустите гель в течение одного часа на восемь вольт на сантиметр.
В конце пробега используйте набор для извлечения геля ДНК в соответствии с протоколом производителя для очистки каждого ампликона. Elute amplicons из колонны с 50 микролитров DNase свободной воды и немедленной центрифугации. Для линейной линии вектора клонирования сначала добавьте один микрограмм вектора, 17 микролитров свободной воды DNase, 2 микролитров буфера реакции и 1 микролитер EcoRI в трубку в течение одного часа инкубации при 37 градусах Цельсия.
В конце инкубации добавьте 0,2 пикомолы линейного вектора 10 микролитров свободной воды DNase и 10 микролитров мастер-микса сборки ДНК к каждому изолированному ампликону. Инкубация образцов при 50 градусах цельсия в течение одного часа. В конце инкубации преобразуем химически компетентную E.coli с двумя микролитерами собранного продукта в соответствии со стандартными протоколами.
Плита 100 микролитров преобразованных клеток на пластины АГАрозы LB дополнена 100 микрограммами на миллилитр ампициллина. После ночной инкубации при 37 градусах по Цельсию выберите хорошо изолированные колонии для прививки в бульоне Лурия, дополненном 100 микрограммами на миллилитр ампициллина на ночь при 37 градусах Цельсия и 225 революциях в минуту. На следующее утро используйте плазмиды miniprep комплект изолировать плазмиды.
И проверить концентрацию и чистоту ДНК на спектрофотометре. Для рекомбинантного генерации вируса заразить смутный монослой подходящих клеток вирусом, который будет рекомбинироваться при множественности инфекции одного из шести хорошо пластины. И инкубировать инфицированные клетки при 37 градусах Цельсия и 5%углекислого газа в течение одного часа.
В конце инкубации замените супернатант в каждой из них свежим DMEM и используя коммерчески доступный трансфектный реагент в соответствии с протоколом производителя. Добавьте три микрограмма вектора рекомбинации, представляющих интерес для каждой из них. Поместите тарелку в инкубатор еще на 48 часов.
Перед объединением клеток из каждого состояния трансфекции в отдельные 1,5 миллилитров труб. Затем заморозить-разморозить объединили клетки три раза, прежде чем sonicating в результате лизатов в течение 15 секунд при 50%амплитуды. Далее, последовательно 10 раз разбавить sonicated лизат, собранный от 10 до первого до 10 до шестой концентрации в свежем DMEM и добавить один миллилитр каждого разбавления отдельных сотых скважин белка киназы R компетентных клеточных линий.
Поместите клетки в инкубатор клеточной культуры в течение одного часа, прежде чем заменить супернатанты свежей средой и вернуть клетки в инкубатор клеточной культуры. Через 24-48 часов определите рекомбинантные вирусы с помощью микроскопии флуоресценции. Таблички от рекомбинантных вирусов выражают красную флуоресценцию благодаря интеграции гена синтеза mCherry-E3L.
Табличка очищает рекомбинантные вирусы три раза на клетках дикого типа RK13. После трех раундов очистки бляшек заразить клетки RK13-E3L-K3L с серийными разбавлениями лизолята налета. Для идентификации рухнувших вирусов с помощью микроскопии флуоресценции с помощью соответствующей системы визуализации, оснащенной кубиками фильтра GFP и RFP.
Затем налет очищает только зеленый VC-R4, или бесцветные E3L бляшки три раза на RK13-E3L-K3L клеток. Обеспечение того, чтобы не бляшки флуоресце красный. Заразить клетки, по крайней мере 100 бляшек формирования единиц, чтобы увеличить ваши шансы на выявление бесцветный налет.
В редких случаях может потребоваться несколько раундов инфекции. Красные флуоресцентные бляшки в белковой киназе R компетентных клеток RK13 свидетельствуют о вирусной экспрессии mCherry-E3L. А бесцветные бляшки или бляшки, выражают только eGFP в ячейках RK13-E3L-K3L, подтверждают коллапс маркера выбора mCherry-E3L.
Рекомбинантный вирус VC-R4, в котором отсутствуют оба белка киназы R антагонисты не могут размножаться в белках киназы R компетентных клеток RK13 в то время как очевидное вирус VP872, который выражает E3L является репликация компетентным. Чтобы подтвердить, что эта неспособность размножаться в клетках RK13 была только из-за потери E3L, расширенный GFP был заменен E3L в вирусе VC-R4. Он создал соответствующий вирус, используя тот же протокол отбора.
Интересно, что при создании этого вируса, бесцветные бляшки в соответствии с коллапсом mCherry-E3L маркер отбора были определены до выбора в RK13'E3L-K3L клеток, которые, как правило, требуется для выбора без шрамов рекомбинантов. Вероятно, из-за расширенной последовательности идентичности между кассетой рекомбинации mCherry-E3L и геном E3L, вставляемым в VC-R4. В среднем 12,6% потомства виньоны прошли рекомбинацию трансфектной плазмидой, как и ранее сообщалось частоты.
Здесь показана частота бесцветных бляшек относительно общего количества бляшек ячеек RK13-E3L-K3L, что свидетельствует о том, что скорость коллапса и потеря маркера отбора mCherry-E3L происходили с частотой примерно 1,8%. На первом этапе использование PKR компетентных клеток гарантирует, что все бляшки с содержащимся рекомбинантным вирусом. На втором этапе использование PKR дефицитных клеток позволяет обнаруживать рекомбинантный вирус с коллапсом локуса mCherry-E3L.
Такой подход позволяет нам быстро генерировать вирусы, содержащие экзогенные гены, например, для производства вакцин предлагают выражение различных вирусных антагонистов PKR. для облегчения анализа видов-специфических взаимодействий с PKR от различных хостов.
