우리의 방법은 다양한 세포 유형에서 재조합 vaccina 바이러스의 효율적이고 원활한 생성을 위해 호스트 범위 선택 및 형광 마커를 사용합니다. 이 기술은 동종 재조합의 속도와 일시적인 지배적 선택의 흉터 특성을 결합합니다. 또한, 화학적으로 유발된 변화의 가능성을 제거하기 위해 범위 선택을 주최합니다.
이 방법은 또한 백신을 생성하기 위하여 외국 유전자를 표현하기 위하여 vaccinia 바이러스 또는 그밖 poxviruses를 수정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 형광 선택으로만 이 프로토콜을 수행하는 경우 PKR 선택적 압력 없이 비교적 희귀한 재조합을 감지하기에 충분한 바이러스를 선별해야 합니다. 이 방법은 형광 마커의 이득과 손실에 의존하여 재조합 카세트를 성공적으로 획득 한 바이러스를 선택하고 흉터가 재결합 된 바이러스를 감지합니다.
재조합 벡터를 생성하려면 먼저 DNase 무료 물 17 마이크로리터, 각 프라이머의 1.2 마이크로리터, 5배 PCR 반응 버퍼 5개 마이크로리터, 템플릿 DNA 및 0.5 마이크로리터의 DNA 폴리머라아제를 앰플리콘당 하나의 PCR 튜브에 추가합니다. DNase 무료 물을 추가하여 각 튜브의 최종 볼륨을 50 마이크로리터로 가져옵니다. 그리고 튜브를 열순환기로 배치합니다.
표시된 대로 3단계 PCR 프로토콜의 25라운드를 사용하기 전에 30초 동안 98도의 섭씨에서 DNA를 녹입니다. 증폭 제품을 1%의 아가로즈 젤에 시각화하려면 각 DNA 제품의 마이크로리터 10개와 각 웰에 적재 버퍼 2개를 추가합니다. 젤을 8볼트퍼센트에서 1시간 동안 실행합니다.
실행의 끝에서, 각 앰플리턴을 정화 하는 젤 제조 업체의 프로토콜에 따라 DNA 젤 추출 키트를 사용 하 여. DNase 무료 물과 즉각적인 원심 분리의 50 마이크로 리터와 열에서 앰프를 엘테. 복제 벡터를 선형화하려면 먼저 벡터 1마이크로그램, DNase 프리 워터 17 마이크로리터, 반응 버퍼 2편, 에코리 마이크로리터 1개를 37도에서 1시간 동안 튜브에 첨가한다.
인큐베이션의 끝에서, DNase 자유물의 선형화된 벡터 10 마이크로리터의 0.2 피코몰을 추가하고, 각 분리된 앰플리콘에 DNA 어셈블리 마스터 믹스10마이크로리터를 첨가한다. 샘플을 섭씨 50도에서 1시간 동안 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 표준 프로토콜에 따라 조립 된 제품의 두 마이크로 리터와 화학적으로 유능한 대장균을 변환합니다.
암피실린 밀리리터당 100 마이크로그램으로 보충된 LB 아가로즈 플레이트에 변형된 세포의 100마이크로리터를 플레이트. 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 잠복한 후, 루리아 국물에 접종을 위해 잘 고립된 식민지를 선택하여 밤새 37도에서 암피실린 밀리리터당 100 마이크로그램과 분당 225개의 회전을 보충합니다. 다음 아침, 플라스미드 미니프렙 키트를 사용하여 플라스미드를 분리합니다.
그리고 분광계에서 DNA의 농도와 순도를 확인한다. 재조합 바이러스 생성의 경우, 6웰 플레이트에서 하나의 감염의 복합성에서 재결합할 바이러스와 적합한 세포의 컨런트 단층을 감염시. 그리고 감염된 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 1시간 동안 배양합니다.
인큐베이션이 끝나면 각 우물의 상체를 신선한 DMEM으로 교체하고 제조업체의 프로토콜에 따라 시판되는 트랜스퍼션 시약을 사용하십시오. 각 웰에 관심의 재조합 벡터의 세 마이크로그램을 추가합니다. 접시를 인큐베이터에 추가로 48시간 동안 배치합니다.
각 형질 전환 조건에서 개별 1.5 밀리리터 튜브로 세포를 풀링하기 전에. 그런 다음 풀링된 세포를 세 번 동결한 후 50%진폭에서 15초 동안 생성된 용액을 초음파 처리합니다. 다음으로, 10배 연속적으로 10배의 초음파 처리된 용액을 희석시키고, 10에서 10에서 6번째 농도로 신선한 DMEM으로 수확하고 단백질 키나아제 R 유능한 세포주의 개별 응수 웰에 각 희석의 1밀리리터를 첨가한다.
세포 배양 인큐베이터에 세포를 1시간 동안 배치한 후 초자연체를 신선한 배지로 대체하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌린다. 24~48시간 후, 형광 현미경검사법에 의한 재조합 바이러스를 식별한다. 재조합 바이러스로부터의 플라크는 mCherry-E3L 융합 유전자의 통합으로 인해 적색 형광을 발현한다.
플라크는 야생 형 RK13 세포에 재조합 바이러스를 세 번 정화합니다. 3라운드의 플라크 정화 후, RK13+E3L+K3L 세포를 플라크 용하의 직렬 희석으로 감염시 보세요. 붕괴된 바이러스를 식별하기 위해 GFP 및 RFP 필터 큐브가 장착된 적절한 이미징 시스템을 사용하여 형광 현미경 검사법에 의해.
그런 다음 플라크는 RK13+E3L+K3L 셀에서 녹색 전용 VC-R4 또는 무색 E3L 플라크를 세 번 정화합니다. 플라크가 빨간색으로 형광되지 않도록 합니다. 적어도 100 플라크 형성 단위로 세포를 감염하여 무색 플라크를 식별할 확률을 높입니다.
드문 경우에, 감염의 다중 라운드가 필요할 수 있습니다. 단백질 키나아제 R 유능한 RK13 세포의 적색 형광 플라크는 mCherry-E3L의 바이러스 성 발현을 나타낸다. 그리고 RK13+E3L+K3L 셀에서 eGFP만 을 발현하는 무색 플라크 또는 플라크는 mCherry-E3L 선택 마커의 붕괴를 확인한다.
단백질 키나아제 R 길항제가 모두 결여된 재조합 바이러스 VC-R4는 단백질 키나아제 R 유능한 RK13 세포에서 복제할 수 없으며, E3L을 표현하는 명백한 바이러스 VP872는 복제능력이 있다. RK13 세포에서 복제할 수 없는 이 무능력이 E3L의 손실 때문이었는것을 확인하기 위해, 향상된 GFP는 VC-R4 바이러스에서 E3L로 대체되었다. 동일한 선택 프로토콜을 사용하여 관련 바이러스를 생성했습니다.
흥미롭게도, 이 바이러스를 만드는 동안, mCherry-E3L 선택 마커의 붕괴와 일치하는 무색 플라크는 일반적으로 흉터 재조합제를 선택하는 데 필요한 RK13+E3L+K3L 셀에서 선택하기 전에 확인되었다. mCherry-E3L 재조합 카세트와 VC-R4로 삽입되는 E3L 유전자 사이의 확장된 서열 정체성 때문일 가능성이 있다. 평균 12.6%의 자손 처녀가 이전에 보고된 주파수와 유사한 전감염된 플라스미드와 재조합을 겪었습니다.
여기서, 총 플라크RK13+E3L+K3L 셀에 비해 무색 플라크의 빈도가 표시되어, mCherry-E3L 선택 마커의 붕괴 속도와 손실이 약 1.8%의 주파수에서 발생하였다. PKR 유능한 세포를 사용하여 첫 번째 단계에서 포함 된 재조합 바이러스를 가진 모든 플라크를 보장합니다. PKR 결핍 세포를 이용한 제2단계에서는 붕괴mCherry-E3L 궤적을 이용한 재조합 바이러스의 검출을 가능하게 한다.
이러한 접근법을 통해 외인성 유전자를 함유한 바이러스를 신속하게 생성할 수 있으며, 예를 들어 백신 생산이 상이한 바이러스 PKR 길항제의 발현을 제공한다. 다양한 호스트로부터 PKR과의 종별 상호 작용의 분석을 용이하게한다.
