Культура органов почек и органеллы, полученные из запрограммированных стволовых клеток, обеспечивают отличные способы изучения механизмов развития почек и болезней. Однако нынешняя система культуры органов не обеспечивает приток крови к почкам. Из-за этого, причина нынешних моделей являются неполными и не в состоянии повторить основную функцию почек, которая является фильтрация крови.
В этой публикации мы представляем улучшенный протокол для выращивания и визуализации эмбриональных почек и органоидов на хориоаллантической мембране куриного эмбриона. В нашем романе экспериментальной создана, мы наложения зачатков почек пересажены на CAM с проницаемым смыслом резервуаров, которые заполнены культуры среды. Этот протокол значительно повышает выживаемость зачатков почек, а также внутренних эндотелиальных клеток.
Метод позволяет приток крови к развивающемуся гломерулу. Недавно мы опубликовали также новый фиксированный набор направления орган культуры метод, который предлагает высокое разрешение конфокальных 3D замедленной визуализации. Метод обеспечил оптимальные условия для долгосрочной конфокальные изображения органоидов и зачатков органов.
В подходе мы аккуратно сжимаем ткань между проскальзывания стеклянной крышки и проницаемой мембраной. Здесь мы покажем, как изготовлены специально разработанные пластины и как настраиваются культурные эксперименты. Таким образом, в этой публикации мы представляем улучшенную технику почечной органеллы труб культуры.
Этот метод предлагает лучший способ моделирования генезиса органеллы и проведения изображений высокого разрешения для изучения эмбриональных почек и почечных органоидов ex vivo. В зависимости от эксперимента возьмите переносные ячейки контра-вставки, предназначенные для шести-хорошо или 12-хорошо пластин. Вырежьте стороны вставки с помощью инструмента Dremel, чтобы создать двухмиллиметровое пластиковое кольцо с проницаемой мембраной, прикрепленной к нему.
Польский края кольца от swarf со скальпелем или острым ножом. Стерилизовать мини-резервуары в 70% этанола, по крайней мере один час. Затем вымойте мини-резервуары в автоклаве дистиллированной водой и высушите их в ламинарный капюшон.
Промыть мини-резервуары в PBS и культуры среды. Поместите резервуар на чашку Петри на вершине нашей капли культуры среды с мембраной лицом вверх. Упорядочить вскрытые ex vivo эмбриональных почек или почечных органоидов на мембране.
Избегайте оставлять много жидкости вокруг образцов и оставить их прилагается от двух до 24 часов в инкубаторе культуры клеток. Экзенальная трансплантация проводится на хориоалантной мембране восьмидневного бывшего эмбрионального цыпленка ово. Перенесите мини-резервуары так, чтобы мембрана покрывала трансплантат.
Поместите их на периферию CAM, чтобы они не покрывали эмбрион. Затем добавьте культурную среду в мини-резервуары. Культивировать образцы на куриный CAM в течение девяти дней, как максимум.
Заменить культурную среду в мини-резервуарах ежедневно. Васкуляризацию образцов можно наблюдать уже через 24-48 часов после трансплантации. Чтобы сделать специально разработанные шесть хорошо пластин для фиксированной культуры.
Вы должны начать с бурения 20 миллиметров отверстий в нижней части пластины с помощью буровой машины с подходящим битом сверла. Затем отполировать диски отверстий на верхней стороне пластины. Наконец, стерилизовать пластины в 70% этанола, по крайней мере один час.
Затем вымойте пластины в автоклаве дистиллированной водой и высушите их в мизерной капюшоне. Вымойте 22x22 миллиметровый покров скользит в 70%этанола и дайте им высохнуть полностью. Клей крышку скольжения на верхней части отверстия в нижней части скважины с помощью ткани клея.
После высыхания осмотрите пластины под стерильным микроскопом и удалите лишний клей. Во-первых, смешать алицит из полистирола бусы с равным объемом водорода. Поместите трансполильную вставку под рассекающий микроскоп с мембраной вверх и расположить почки на мембране.
Добавить каплю смеси гидро-гель шарик рядом с почками тщательно. Переверните трансфилловую вставку так, чтобы мембрана и почки были обращены вниз. Затем аккуратно поместите вставку в наш колодец специально разработанной пластины из шести хорошо.
Нажмите вставку очень осторожно в колодец. Следуйте степени уплощения из микроскопа, пока почка находится на уровне с бисером. Держите вставку слегка прижатой к хорошо с одной стороны и исправить его на тарелку путем плавления пластика в трех точках на периферии вставки с припоем железа.
Добавить два миллилитров культуры среды в колодец через отверстие на стороне. При запуске изображений замедленного действия перенесите пластину в инкубатор перевернутого микроскопа на сцене. Наш модифицированный протокол захвата CAM позволяет высокоэффективную васкуляризацию почечных органоидов и эмбриональных почек.
Многие резервуары, содержащие культурную среду, снабжают донорскую ткань и защищают ее от высыхания в течение первоначального периода времени, исходящего из васкуляризатона. Этот фильм показывает поток клеток куриной крови в эмбриональном центре почек мыши привиты куриный CAM и культурные в течение семи дней. Эта панель рисунков показывает, что наш улучшенный метод культуры CAM обеспечивает разрешительные условия для почечных эндотелиальных клеток.
Цифры А и В показывают эмбриональные почки, выращенные в течение пяти дней в интервале дней культуры были центр привиты куриный CAM в течение пяти дней. Окрашивание с помощью мыши специфики CD-31 антитела показывает, что эндотелиальной клеточной сети почечного центра привиты CAM является более обширным, чем в левой стороне управления. На рисунке C мы видим, что кровеносные сосуды мыши окрашены мышью конкретных CD-31 антитела, и это больше всего с куриными кровеносными сосудами.
Цифры D и E показывают криозиции эмбриональных почек мыши, выращенных на культуре путешествий или куриного CAM в течение пяти дней и окрашенных CD-31 и Hoechst. Glomeruli сосуды более зрелые в почках, культурных на куриный CAM, чем в культурах контроля. На рисунке F показана эмбриональная почка мыши, выученная на CAM трансгенного цыпленка GFP в течение семи дней.
Эндотелиальные клетки мыши окрашены антителами CD-31, и мы можем наблюдать, что сосуды в ксенотрансплантированных почках мыши в основном, но не исключительно мыши полученных. Новая культура фиксированного направления набора позволяет культивирование эмбриональных почек и органоидов на ограниченном расстоянии. В традиционной культуре путешествий культурные органы помещаются на фильтр, который хранится в воздушном интерфейсе металлической сетки.
Этот метод обеспечивает хорошие условия для развития и роста, но не является оптимальным для визуализации. В фиксированном наборе культуры направления, культурный орган нажат между стеклянным дном блюда и мембраны и толщина его контролируется полистирол шарики, работающие в качестве раскаленников здесь. Развивающиеся органы могут быть изображены прямо через стекло крышки, давая улучшенный вид органа.
Эта панель рисунков показывает, что эмбриональные почки и органоиды почек могут быть выучтированы в методе фиксированной культуры направления. Яркие полевые изображения эмбриональных почек и органоидов почек на седьмой день показывают нормальное развитие. На рисунке C экспрессия GFB была активирована в развивающихся нефронах органоида почек на рисунке D показывает почку с травмой одного окрашивания на euretric бутон и шесть двух окрашивания маркировки нефроновых клеток-предшественников.
Цифры E и F представляют мышеловку, культурную в течение 12 дней. Травма один и nephron окрашивания показывают eurethric бутон и подоциты. Фильм тоже представляет эмбриональной почки MTMG, Тайвань кри происхождения, где Тайвань кри вызывает экспрессию GFB в эндотелиальных клеток.
Мы видим, что почечные эндотелиальные клетки присутствуют в развивающейся эмбриональной почки и эндотелиальной сети может также развиваться в методе культуры. В панели справа можно увидеть, как эндотелиальные клетки мигрируют в сосудистую расщелину S-образного стадии нефрона. Здесь мы представили улучшенный протокол ксенотрансплантации почечных органоидов и эмбриональных почек куриного КАМА.
Этот протокол значительно повышает выживаемость зачатков почек, а также их внутренних эндотелиальных клеток. Метод позволяет приток крови к развивающемуся гломерулу. Другой протокол, представленный здесь, является фиксированным методом культуры органов, который улучшает качество изображения и помогает изучать генезис органеллы на уровне одной клетки.
Изображения с высоким разрешением подходят для автоматической сегментации клеток и компьютерного исследования клеточного поведения в почечных органоидах и культурах почек.
