Nierenorgankultur und Organellen, die aus programmierten Stammzellen gewonnen werden, bieten hervorragende Möglichkeiten, Mechanismen hinter Nierenentwicklung und Krankheit zu untersuchen. Das aktuelle Organkultursystem sorgt jedoch nicht für einen Blutfluss in die Niere. Aus diesem Grund sind die aktuellen Modelle unvollständig und lassen die Hauptfunktion der Niere, die Blutfiltration, nicht rekapitulieren.
In dieser Publikation stellen wir ein verbessertes Protokoll zur Kultivierung und Visualisierung von Embryonieren und Organoiden auf der chorioallantoischen Membran von Hühnerembryonen vor. In unserem neuartigen Versuchsaufbau überlagern wir die auf CAM transplantierten Nierenrudimente mit durchlässigen Bedeutungsreservoirs, die mit Kulturmedium gefüllt sind. Dieses Protokoll erhöht signifikant das Überleben von Nierenrudimenten und auch der intrinsischen Endothelzellen.
Die Methode ermöglicht den Blutfluss zum sich entwickelnden Glomerulus. Kürzlich haben wir auch eine neuartige Festpunkt-Richtungs-Organkulturmethode veröffentlicht, die hochauflösende konfokale 3D-Zeitraffer-Bildgebung bietet. Das Verfahren bot optimale Bedingungen für die langfristige konfokale Bildgebung der Organoide und Organrudimente.
Beim Anflug komprimieren wir das Gewebe sanft zwischen einem Glasdeckel-Schlupf und einer durchlässigen Membran. Hier zeigen wir, wie die individuell gestalteten Platten hergestellt werden und wie die Kulturexperimente aufgebaut werden. So stellen wir in dieser Publikation eine verbesserte Nierenorganellen-Tubing-Kulturtechnik vor.
Diese Methode bietet eine bessere Möglichkeit, organelle Genese zu modellieren und hochauflösende Bildgebung durchzuführen, um embryonale Nieren und Renalorganoide ex vivo zu untersuchen. Je nach Experiment nehmen Sie Transferzell-Kontraeinsätze für Sechs-Well- oder 12-Well-Platten. Schneiden Sie die Seiten des Einsatzes mit einem Dremel-Werkzeug ab, um einen zwei Millimeter hohen Kunststoffring mit einer durchlässigen Membran zu erstellen.
Polieren Sie die Ränder des Rings aus Späne mit einem Skalpell oder einem scharfen Messer. Sterilisieren Sie die Mini-Reservoirs in 70% Ethanol für mindestens eine Stunde. Dann waschen Sie die Mini-Reservoirs im Autoklaven mit destilliertem Wasser und trocknen Sie sie in einer laminaren Haube.
Spülen Sie die Mini-Reservoirs in PBS und Kulturmedium. Legen Sie das Reservoir auf eine Petrischale auf unserem Tropfen Kulturmedium mit der Membran nach oben. Ordnen Sie sezierte ex vivo embryonale Nieren oder Renalorganoide auf der Membran an.
Vermeiden Sie es, viel Flüssigkeit um die Proben herum zu lassen und sie von zwei bis 24 Stunden in einem Zellkultur-Inkubator anbringen zu lassen. Exenale Transplantation erfolgt an der chorioallantoischen Membran des acht Tage alten ex ovo embryonalen Huhns. Übertragen Sie die Mini-Reservoirs, so dass die Membran das Transplantat bedeckt.
Legen Sie sie in die Peripherie des CAM, damit sie den Embryo nicht abdecken. Dann fügen Sie Kulturmedium zu den Mini-Reservoirs hinzu. Kultivieren Sie die Proben auf Huhn CAM für neun Tage als maximum.
Ersetzen Sie das Kulturmedium in den Mini-Reservoirs täglich. Die Vaskularisation der Proben kann bereits 24 bis 48 Stunden nach der Transplantation beobachtet werden. Um die maßgeschneiderten Sechs-Brunnen-Platten für die feste Kultur zu machen.
Sie müssen beginnen, indem Sie 20-Millimeter-Löcher in den Boden der Platte mit einer Bohrmaschine mit einem geeigneten Bohrer bohren. Als nächstes polieren Sie die Felgen der Löcher auf der Oberseite der Platte. Schließlich sterilisieren Sie die Platten in 70% Ethanol für mindestens eine Stunde.
Dann waschen Sie die Platten im Autoklaven mit destilliertem Wasser und trocknen Sie sie in Lemiar Haube. Waschen Sie die 22x22 Millimeter Abdeckung rutscht in 70% Ethanol und lassen Sie sie vollständig trocknen. Kleben Sie den Deckelschlupf auf ein Loch in der Unterseite eines Brunnens mit Gewebekleber.
Nach dem Trocknen die Platten unter sterilem Mikroskop inspizieren und den überschüssigen Kleber entfernen. Mischen Sie zunächst ein Aliquot aus Polystyrolperlen mit einem gleichen Wasserstoffvolumen. Legen Sie den Transfill-Einsatz unter ein Sezierendes Mikroskop mit nach oben gerichteter Membran und ordnen Sie die Nieren auf der Membran an.
Fügen Sie einen Tropfen Hydro-Gel-Perlen-Mischung neben den Nieren sorgfältig. Drehen Sie den Transfill-Einsatz so um, dass die Membran und die Nieren nach unten gerichtet sind. Dann legen Sie den Einsatz vorsichtig in unseren Brunnen der maßgeschneiderten Sechs-Brunnen-Platte.
Drücken Sie den Einsatz sehr sanft in den Brunnen. Folgen Sie dem Grad der Abflachung vom Mikroskop, bis die Niere auf dem Niveau mit den Perlen ist. Halten Sie den Einsatz mit einer Hand leicht auf den Brunnen gedrückt und fixieren Sie ihn an der Platte, indem Sie Kunststoff an drei Stellen am Rand des Einsatzes mit einem Lötkolben schmelzen.
Fügen Sie zwei Milliliter Kulturmedium in den Brunnen durch eine Öffnung auf der Seite. Übertragen Sie die Platte beim Starten einer Zeitraffer-Bildgebung in den inter inkubierten Inkubator eines invertierten Mikroskops. Unser modifiziertes CAM-Capture-Protokoll ermöglicht eine hocheffiziente Vaskularisation von Nierenorganoiden und embryonalen Nieren.
Viele Reservoirs, die Kulturmedium enthalten, liefern Spendergewebe und schützen es vor dem Trocknen während der Anfangsphase des Vascularizatons. Dieser Film zeigt den Fluss von Hühnerblutzellen in einem embryonalen Maus-Nierenzentrum, das an Hühner-CAM gepfropft und sieben Tage lang kultiviert wurde. Diese Abbildung zeigt, dass unsere verbesserte CAM-Kulturmethode freizügige Bedingungen für die renal abgeleiteten Endothelzellen bietet.
Die Abbildungen A und B zeigen, dass embryonale Nieren, die fünf Tage lang an Tagen angewachsen sind, fünf Tage lang an Hühner-CAM transplantiert wurden. Die Färbung mit Maus-Spezifischen CD-31 Antikörper zeigt, dass das Endothelzellnetzwerk des Nierenzentrums, das an CAM transplantiert wurde, umfangreicher ist als bei der linken Seitensteuerung. In der Abbildung C sehen wir, dass Maus-Blutgefäße mit mausspezifischem CD-31-Antikörper befleckt sind und das ist die größte Mitnahme von Hühnerblutgefäßen.
Die Abbildungen D und E zeigen Kryosections von Maus-Embryonalnieren, die fünf Tage lang auf Reisekultur oder Hühner-CAM angebaut und mit CD-31 und Hoechst befleckt sind. Die glomeruli vasculature ist in Nieren, die auf Hühner-CAM kultiviert werden, reifer als in Kontrollkulturen. Abbildung F zeigt eine Maus embryonale Niere, die sieben Tage lang auf CAM eines transgenen GFP-Huhns kultiviert wurde.
Die Maus-Endothelzellen sind mit CD-31-Antikörpern gefärbt und wir können beobachten, dass die Vaskulatur in xenotransplantierten Mausnieren meist, aber nicht ausschließlich mausabgeleitet ist. Die neuartige feste Richtungskultur ermöglicht die Kultivierung embryonaler Nieren und Organoide in einem begrenzten Abstand. In einer traditionellen Reisekultur werden die kultivierten Organe auf einen Filter gelegt, der in einer Luftmittelschnittstelle durch ein Metallgitter gehalten wird.
Diese Methode ermöglicht gute Bedingungen für die Entwicklung und das Wachstum, ist aber nicht optimal für die Bildgebung. In der festen Richtungskultur wird das kultivierte Organ zwischen einem Glasboden der Schale und einer Membran gepresst und die Dicke wird von den Hieralstyrolperlen gesteuert, die als Spacer arbeiten. Die sich entwickelnden Organe können direkt durch das Deckglas abgebildet werden, was den besseren Blick auf das Organ gibt.
Diese Abbildung zeigt, dass die embryonalen Nieren und Nierenorganoide in der festen Richtungskulturmethode kultiviert werden können. Helle Feldbilder von embryonalen Nieren und Nierenorganoiden am siebten Tag zeigen eine normale Entwicklung. In der Abbildung C wurde die GFB-Expression in den sich entwickelnden Nephronen eines Nierenorganoids durch die Figur D aktiviert, die eine Niere mit traumaweise einer Färbung an der euretric Knospe und sechs zwei Färbungen zeigt, die die Nephron-Vorläuferzellen markieren.
Die Figuren E und F stellen die Maus niere 12 Tage lang kulturbeschaffen dar. Das Trauma eins und Nephron Färbung zeigen die eurethrische Knospe und Podociten. Auch der Film präsentiert eine embryonale Niere aus MTMG, Taiwan Cree Ursprung, wo die Taiwan Cree EXB-Expression in Endothelzellen induziert.
Wir können sehen, dass die renalen Endothelzellen in der sich entwickelnden embryonalen Niere vorhanden sind und das Endothelnetzwerk sich auch in der Kulturmethode entwickeln kann. Im Panel rechts sehen Sie, wie Endothelzellen in den Gefäßspalten eines S-förmigen Bühnennephrons wandern. Hier haben wir das verbesserte Protokoll für die Xenotransplantation von Nierenorganoiden und embryonalen Nieren an Hühner-CAM vorgestellt.
Dieses Protokoll erhöht signifikant das Überleben von Nierenrudimenten und auch deren intrinsischen Endothelzellen. Die Methode ermöglicht den Blutfluss zum sich entwickelnden Glomerulus. Das andere hier vorgestellte Protokoll ist die Methode der festen Richtung s/organkultur, die die bildgebende Qualität verbessert und hilft, die Organellengenese auf Einzelzellebene zu untersuchen.
Die hochauflösenden Bilder eignen sich für die automatisierte Zellsegmentierung und computergestützte Untersuchung des zellulären Verhaltens in Nierenorganoiden und Nierenkulturen.
