В этом протоколе мы описываем процедуру, содержащую две части. Во-первых, метод дифференциации монослой 2D кератиноцитов в пробирке при контактном ингибировании. Во-вторых, его молекулярная характеристика РНК-сек.
Метод дифференциации 2D in vitro прост и прост в работе. Он может быть использован для изучения эпидермальной дифференциации, особенно когда большое количество клеток необходимо. Например, в эпигеномном анализе.
Детальный анализ РНК-сек является ясным и прозрачным для исследователей с базовыми навыками биоинформатики, и он может быть использован для любого массового анализа РНК-сек. При выполнении протокола дифференциации в первый раз, имейте в виду, что плотность посева может быть сложно. Попробуйте несколько плотности посева, чтобы узнать, какой из них работает лучше всего с вашей линии клеток.
Начните с подготовки кератиноцитов среднего роста или KGM и 500 миллилитров каждого из среды распространения и дифференциации среды в соответствии с рукописными направлениями. Семена первичных кератиноцитов при плотности от 5 до 20 000 клеток на сантиметр в квадрате и добавить достаточное количество среды пролиферации, чтобы покрыть клетки. Через два дня после посева освежите клетки средой пролиферации.
Регулярно проверяйте клетки под микроскопом и обновляйте носитель через день. Когда клетки достигают 90%-го слияния, индуцировать дифференциацию, изменяя среду на дифференциацию среды. Чтобы собрать клетки для дальнейшего анализа РНК, мыть клетки дважды с DPBS, а затем добавить буфер лиза.
Соберите ячейки в дни дифференциации ноль, два, четыре и семь. После изоляции РНК будет преобразована двухместная кДНК, а библиотеки РНК-сек будут подготовлены к последовательности следующего поколения. После секвенирования считывания последовательность будет загружена и отображена на геном человека.
После загрузки и установки R-пакетов генерируем таблицу учетной записи из таблицы readspergene.out. файлы вкладок и написать образец файла данных, содержащий все имена файлов, день дифференциации и другие соответствующие выборочных данных. Например, обратитесь к дополнительным файлам кодирования.
Затем используйте таблицу подсчета и выборочных данных для создания объекта deseq2, содержащего как подсчитываемые, так и выборочных данных. Для нормализации экспрессии генов нормализуйте таблицу подсчета в объекте deseq2, используя либо deseq2RLD, либо нормализацию VST. Хотя нормализация RLD предпочтительнее, нормализация VST происходит гораздо быстрее.
Используйте функцию dist в R для построения выборочных расстояний на основе нормализованной интенсивности считывания, а затем выполните кластеризацию хклюста на основе выборочных расстояний. Далее нарисуйте тепловую карту с помощью функции pheatmap. Наконец, создайте принципиальный анализ компонентов или PCA участок нормализованного считываемого счета интенсивности, используя функцию plotPCA deseq2.
PCA служит инструментом в исследовательском анализе данных и может быть использован для визуализации расстояния и связи между различными образцами. Выполните высоко переменный анализ экспрессии генов с функцией rowVars, которая извлекает 500 лучших высоко переменных генов, заказывая дисперсию между образцами из разных точек времени. Эти гены имеют самое высокое стандартное отклонение их нормализованной интенсивности в дни дифференциации.
Выполните кластеризацию k-средств на сильно переменных генах, чтобы сгруппить их различными шаблонами выражения. Визуализуй гены на тепловой карте с помощью пакета pheatmap. Интенсивность, построенная на тепловой карте, является нормализованной интенсивностью deseq2 со средним значением.
Создайте список выраженных фоновых генов, который включает в себя все гены с более чем 10 графами в одном образце и составить список с генами из каждого кластера. Наконец, выполните генно-онтологический анализ с помощью GOrilla. Используйте фоновый список генов в качестве фонового набора и список сильно переменных генов в кластерах в качестве целевого набора, а затем нажмите на поиск обогащенных терминов GO.
Кроме того, более продвинутые пользователи R могут использовать пакет clusterProfiler для автоматизации анализа термина GO. Линии кератиноцитов, полученные от пяти особей, использовались для дифференциации в анализах РНК-сек. Основной анализ компонентов показал, что кератиноциты, проходящие дифференциацию, связаны, но имеют различные общие профили экспрессии генов.
Высоко переменные гены были сгруппированы для визуализации динамики экспрессии генов и моделей во время дифференциации. Каждое скопление генов было представлено генами дифференциации кератиноцитов, а аннотация генной онтологии показала явную разницу в функциях генов. Во втором эксперименте различия в морфологии клеток и экспрессии генов сравнивались между кератиноцитами от здорового контроля и клеточными линиями, полученными от пациентов с мутациями P63.
Основной анализ компонентов показал, что линии контрольных клеток явно следовали модели дифференциации, но модель экспрессии генов мутантных клеток во время дифференциации остается в значительной степени похожей на модель размножающихся или недифференцированных клеток. В анализе кластеризации гены в кластере один были вниз регулируется в контрольных клетках и частично регулируется в клетках пациента, несущих R204W и R279H мутаций, но оставался высоким в клетках, несущих R304W. Эти гены, вероятно, играют роль в пролиферации клеток, как показано на анализе генной онтологии.
Кластер два гена были сначала введены, а затем вниз регулируется в контрольных клетках. Эти гены, вероятно, участвуют в дифференциации кератиноцитов, так как эпидермальная дифференциация и функции кератинизации были сильно обогащены для этого кластера. Гены в кластере три были вызваны только в конце дифференциации в контрольных клетках, что указывает на то, что они могут играть роль во внешнем слое эпидермиса.
При анализе данных РНК-сек важно заранее знать, чего ожидать. Это поможет вам как с интерпретацией контроля качества и PCA участок и в оценке, если ваши результаты имеют смысл. Наши методы могут быть использованы для изучения транскрипции генов как в эпидермальной биологии, так и в других биологических системах.
