Магнитные наночастицы являются идеальными инструментами для аналитической науки и нано-медицины благодаря своим сильным магнитным свойствам и легкой функционализации их поверхности. Мы сообщаем здесь первый случай спряжения между аминокислотами функционализированных магнитных частиц кремнезема и siderophore фероксамина вместе с оценкой для захвата фотогеничного материала. Siderophores небольшие, органические молекулы, которые играют ключевую роль в механизме участия железа, и они признаются конкретными внешними мембранными рецепторами бактерий.
Это видео отображает, шаг за шагом, эффективный протокол для подготовки магнитных наночастиц железа. Затем они были покрыты кремнеземом для защиты дисперсии и защиты магнитного ядра. Полученная поверхность реактора была функционализирована с группами амина.
Синтез магнитных наночастиц, конъюгированных с фероксамином. Добавьте 0,5 грамма Fe (acac)3 в стеклянный флакон 20 мл. Затем смешайте с 10 мл бензилового спирта.
Sonicate этой смеси в течение 2 минут. Затем перенесите в отопительный блок и нагрейте при температуре 180 градусов по Цельсию в течение 72 часов. Промыть наночастицы 96% этанола.
И центрифуга на 30 минут. Отделяйте наночастицы от супернатанта магнитным притяжением, используя магнит неодимия. Откажитесь от остаточного растворителя.
Откажитесь от супернатанта, чередуясь с звуковым сигналом, пока растворитель не выглядит ясным. Приготовьте суспензию 2 грамма МНП в 80 миллилитров изопропанола, добавьте 4 миллилитров 21%аммиака, 7,5 миллилитров дистиллированной воды и 0,56 миллилитров TEOS. Нагрейте смесь при температуре 40 градусов по Цельсию в течение 2 часов, с непрерывным перемешиванием.
Затем, sonicate в течение 1 часа. Отделить MNP с магнитом, отбросить супернатант, разогнать его в 30 миллилитров изопропанола, добавить аммиак, дистиллированной воды и TEOS, в том же порядке, как описано ранее. Нагрейте смесь при температуре 40 градусов по Цельсию в течение двух часов с непрерывным перемешиванием.
Затем, sonicate в течение одного часа. Снимите и удобно промыть магнитный бар перемешать, чтобы восстановить весь материал. Откажитесь от супернатанта и промойте наночастицы 96%этанолом три раза, чередуясь с звуковой.
Высушите наночастицы под вакуумом при комнатной температуре в течение 12 часов. Промыть 500 миллиграммов MNP@SIO2 полученных от предыдущего шага с диметилформамидом. Sonicate их и отказаться.
Повторно приостанавливайте частицы в колбе круглого дна, перемешивайте с помощью магнитного батончика и добавляйте 9 миллилитров APTES. Перемешать смесь при 60 градусах по Цельсию в течение 12 часов. Откажитесь от супернатанта и промойте наночастицы 96%этанолом три раза, чередуясь с звуковой.
Растворите 100 мг дефероксамина, мезилатной соли и 53,0 миллиграмма ацетилацетоната железа в 5 миллилитров дистиллированной воды. Перемешать смесь на ночь при комнатной температуре. Вымойте полученный продукт три раза с 20 миллилитров этилового ацетата в разделительной воронке.
Удалите органический растворитель под вакуумом. Заморозить-сухой акальной фазы, чтобы позволить себе фероксамин и красный твердый. Добавьте 350 миллиграммов сукцинового ангидрида в раствор 100 мг фероксамина в 5 миллилитров пиридина в 50 миллилитров круглой нижней колбы.
Перемешать полученную смесь при комнатной температуре в течение 16 часов. Удалите избыток пиридина под пониженным давлением. Растворите реакцию сырой в 3 миллилитров метанола.
Перенесите метаноличный раствор в колонку LH-20 и элют на 0,5 мл/минуту. Соберите красную фракцию и удалите метанол под вакуум. Промыть 30 мг сухого амина функционализированных наночастиц в два раза с DMF и sonicate наночастиц в 100 миллилитров Erlenmeyer колбу в течение 30 минут.
Подготовка раствора 200 миллиграммов N-succinylferoxamine, 173 миллиграмма бензотриазола 1-yl-oxy-tris-фосфония гексафторофосфата BOP, 46 мг 1-гидроксибензотриазола HOBt и 128,8 миллиграммов N, N-diisopropylethylamine DIPEA, в 10 мл DMF, в 50 миллилитров круглый дно. Приостановить ранее промытые MNP@SiO2@NH2 в 3 миллилитра DMF, под sonication в сухих и без кислорода условиях. Используйте атмосферу аргона.
Добавить, dropwise, смешать, чтобы смешать B.Shake окончательной смеси, используя орбитальный шейкер, при комнатной температуре на ночь. Отделите полученный конъюг от подвески с помощью магнита. Бактериальный анализ штаммов Y.enterocolitica для количественной оценки изоляции и улавливания патогенных бактерий с наночастицами.
Подготовьте подвеску всех промежуточных наночастиц и окончательный конъюгировать в PBS при 1 мг/мл в стерильных трубках. Приготовьте культуру Y.entorocolitica в 5 мл Luria Bertani, LB, бульон на ночь. Приготовьте 5 мл железа дефицитного соевого бульона, TSB, путем добавления 50 микролитров 10 мМ 2, 2-бипиридилового раствора.
Привить 5 миллилитров железа недостаточно TSB бульон с 50 микролитров ночной культуры Y.enterocolitica. Инкубировать при 37 градусах Centigrades с волнением, пока OD600 от 0,5 до 0,8 не достигается. Возьмите 100 микролитров ночной культуры и разбавьте его в трубку, содержащую 900 микролитров PBS, чтобы получить первые 1/10 разбавления.
Затем, подготовить 1/100 разбавления от первого разбавления с использованием той же процедуры, чтобы получить концентрацию бактериальных клеток на 10 к власти 6 единиц колонии формирования на миллилитр примерно. Добавьте 100 микролитров подвески наночастиц и 1 мг/мл в 1 миллилитр разбавления 1/100 бактерий. Разделите агрегаты бактерий MNP, используя магнит, отбросьте, тщательно, supernatant.
Промыть разделенные наночастицы дважды с 1 миллиметром PBS с помощью вихря. Подготовка четырех последовательных 1/10 разбавления от прежней подвески, до 10 до мощности минус 4 разбавления. Плита 10 микролитров каждого разбавления на пластины TS агара.
Фотография пластины с гелем digitalizer в эпи белый режим. Обработать изображение, используя удобное программное обеспечение, чтобы усилить место для подсчета количества отдельных колоний. Чтобы подтвердить формирование ковалентной связи между наночастицами и siderophore, мы используем FT-IR Raman спектроскопии для мониторинга синтеза, наблюдая, как новые полосы появляются в согласии с новыми функциональными группами на каждом шагу.
Микроскопия TEM и SEM использовалась для наблюдения за морфологией и размером частиц. Термогравиметрический анализ для измерения потери веса за счет добавления органического материала. А XPS позволяет анализировать различные состояния окисления атомов на поверхности и подтверждать образование ковалентных связей.
Наконец, мы использовали все промежуточные на окончательном конъюгации, чтобы проверить его способность захвата бактерий, с тем чтобы установить их свойства в качестве биосенсора. Этот протокол был разработан, чтобы воспользоваться высокой биосовместимостью наночастиц магнетитов. Покрытие кремнеземом улучшает дисперсию и защищает магнитное ядро от деградации в акальных средствах массовой информации.
А также дать реактивной поверхности для функционализации с амина групп, которые необходимы для ковалентно связать кислоты модифицированных siderophore карбодимид химии. В этом случае, N-succynilferoxamine. Возможность захвата конъюгированных бактерий была протестирована, и в результате было обнаружено небольшое количество колоний, без существенной разницы с промежуточными из-за специфического взаимодействия на громоздких эффектов, представленных в бактериальной суспензии PBS.
