Сегодня мы продемонстрируем два протокола, которые демонстрируют, как изучать функцию НК-клеток. Есть два ключевых аспекта функции НК-клеток, которые в состоянии искоренить опухолевые клетки, и он способен мигрировать в микро-среду опухоли. Эти два протокола мы продемонстрируем способность НК-клеток искоренить опухолевые клетки, а также он способен мигрировать в микросреду опухоли.
Таким образом, два протокола, которые мы собираемся продемонстрировать сегодня, просты, не требуют использования радио деятельности и могут быть установлены в большинстве лабораторий, которые имеют возможность выполнять работу молекулярной биологии и клеточной культуры. Суреш Бугиде и Суреш Чава, которые являются двумя постдокторантами в моей лаборатории, продемонстрируют эти два протокола сегодня. Два оценить НК-клеток опосредовано цитотоксичности с помощью LDH, сначала растут линии рака печени человека до 70-80% слияния в 100 миллиметров клеточной культуры Петри блюдо при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.
В день эксперимента, мыть культуру с пятью миллилитров PBS перед лечением клеток с одним миллилитр 0,25%трипсина ЭДТА, пока клетки отделились от нижней пластины. При получении одноклеточной суспензии добавьте к клеткам 10 миллилитров среды клеточной культуры и перенесите клетки в 15 миллилитровую коническую трубку для центрифугации. Вымойте клеточные гранулы с пятью миллилитров PBS перед повторной приостановки клеток в один раз от 10 до 5 клеток на миллилитр свежей культуры средней концентрации.
Далее, семена 100 микролитров целевых раковых клеток печени человека на колодец в тройном состоянии лечения в 96 хорошо пластины и добавить один раз 10 к 5-й человеческой НК-клеток в 100 микролитров среднего к каждой целевой клетки хорошо. Затем поместите тарелку в инкубатор клеточной культуры на три часа. В конце инкубации гранулы клеток центрифугации и передачи 100 микролитров супернатанта из каждого колодца в отдельные скважины новой пластины 96 скважин.
Добавьте 50 микролитров субстрата LDH к каждому колодец с тщательным смешиванием и инкубировать пластину в течение 20 минут при комнатной температуре, защищенной от света. В конце инкубации, остановить реакцию с 50 микролитров стоп-раствора и немедленно измерить абсорбцию на пластине читателя на 490 и 680 нанометров. Затем используйте формулу для расчета процентной цитотоксичности нк-клеток.
Для оценки НК-клеток опосредовано цитотоксичность с использованием кальцеина AM после выращивания клеток линии раковых клеток печени человека до 70-80% стечения, как это было продемонстрировано повторно приостановить клетки в трех миллилитров сыворотки свободной DMEM и этикетки клеток с 1,5 микролитров 10 миллимолярный кальциен AM решение в течение 30 минут при комнатной температуре. В конце инкубации, собирать клетки центрифугации и мыть клетки два раза с пятью миллилитров PBS за стирку. Повторно приостанавливать клетки в один раз от 10 до 5 клеток на миллилитр культуры средней концентрации и добавить 100 микролитров клеток к каждому колодец из 96 хорошо пластины в тройном состоянии лечения.
Далее, в один раз от 10 до 5 человеческих НК-клеток в 100 микролитров культуры среды к каждому колодец целевых клеток и поместить пластину в инкубатор культуры клеток в течение четырех часов. После окончания инкубации, захватить по крайней мере 10 различных полей изображений кальцина AM положительные клетки для каждой репликации каждого состояния лечения на флуоресценции микроскопа в 10 раз больше. Затем вычислите процент цитотоксиситности с помощью формулы.
Для измерения миграции НК-клеток в ответ на хемотаксических стимулов собирают клетки НК человека из 70-80%-ной культуры слияния и повторно приостанавливают клетки в 2,5 раза от 10 до 6 клеток на миллилитр свободной от сыворотки НК-клеток культуры средней концентрации. Далее добавьте 600 микролитров среды, свободной от сыворотки, содержащей химио-аммиант НК-клеток, представляющий интерес для каждой колодец, и поместите одну вставку культуры диаметром 6,5 миллиметра с пятью микрометровыми порами в каждую колодец среды. Затем добавьте 100 микролитров НК-клеток в верхний отсек каждой вставки и поместите пластину в инкубатор клеточной культуры на четыре часа.
В конце инкубации перенесите весь объем непритязателей мигрировавших клеток из нижней части каждого а в отдельные пятими миллилитровые трубки FACS и добавьте 50 микролитров заранее определенного количества цитометрии потока, подсчитывая бисер к каждой трубке. Затем с помощью цитометра потока оцените каждый образец клетки в соответствии со стандартными протоколами цитометрического анализа потока и вычислите абсолютное количество мигрирующих НК-клеток с помощью формулы. Нокдаун ATF4 значительно снижает цитотоксичность НК-клеток по сравнению с НК-клетками, выражаюми неспецифическую короткую РНК шпильки.
После окрашивания кальцином AM количество жизнеспособных раковых клеток печени человека уменьшается после совместной культуры с клетками НК человека по сравнению с раковыми клетками печени человека, культурными без НК-клеток. Как и ожидалось, ATF4 нокдаун через короткие шпильки РНК уменьшает НК-клеток опосредованное убийство раковых клеток печени человека, о чем свидетельствует большее количество кальцина AM-положительных клеток в этих культурах. Кроме того, значительно большее количество миграции НК-клеток наблюдается в ответ на хемокин-содержащую среду по сравнению с НК-клетками, подвергаемыми воздействию контрольной среды без хемокина.
Для оценки цитотоксичности нк-клеток важно стандартизировать наши усилия и целевые соотношения и инкубацио время для каждой линии раковых клеток. После того, как стандарты определены и проверены в пробирке оценки дополняются in vivo мышей эксперименты для дальнейшей оценки их роли в искоренении опухолевых клеток.
