Золотистый стафилококк является грамположительной бактерией, которая производит широкий спектр факторов вирулентности, которые способствуют патогенеза. К ним относятся двухкомпонентные лейкотоксины, которые нарушают целостность мембраны полиморфонуклеарных лейкоцитов, также называемых ПМН или нейтрофилов. Это видео иллюстрирует изоляцию ПМН от всей крови человека и два различных анализа для количественной оценки цитотоксии S.aureus против этих важных врожденных иммунных клеток.
Все эти анализы могут быть выполнены с помощью стандартного лабораторного оборудования и легко адаптируются для изучения других аспектов взаимодействия патогенов-хозяина. В этих экспериментах будет использоваться целая кровь, полученная от доноров-людей, и потребуется одобрение соответствующего институционального комитета или совета по обзору, а также заявление о том, что информированное согласие было получено от всех участников. Первым шагом этой процедуры является изоляция нейтрофилов с помощью центрифугации и градиентов плотности.
Во-первых, принести 50 миллилитров 3%декстран 0,9%хлорида натрия, 35 миллилитров 0,9% хлорида натрия, 20 миллилитров 1,8% хлорида натрия, 12 миллилитров 1,077 грамма на миллилитр раствора фиколла и 20 миллилитров воды до комнатной температуры. Перенесите 25 миллилитров свеженатянутой гепаринированной всей человеческой крови в две конические центрифуги. Объедините 25 миллилитров свеженатянутой гепаринизированной цельной крови с 25 миллилитров эквивалентного объема комнатной температуры, 3%декстран, 0,9% хлорида натрия в соотношении один к одному.
Смешайте, аккуратно качая каждые 50 миллилитров конической трубки, а затем дайте постоять при комнатной температуре в течение 30 минут. После инкубации при комнатной температуре появятся два отдельных слоя. Перенесите верхний слой каждой декстранной смеси крови в новые 50 миллилитровые конические трубки.
Центрифуга при температуре 450 г в течение 10 минут при комнатной температуре с низкими перерывами или без них. Тщательно аспирировать как supernatants и отказаться, не нарушая ячейки гранулы. Аккуратно повторное потребление каждой клеточной гранулы в двух миллилитрах 0,9% хлорида натрия.
Комбинат перерасход гранулы в одном, 50 миллилитров конической затем добавить оставшиеся 0,9% хлорида натрия в окончательный объем 35 миллилитров. Тщательно наложить 10 миллилитров по 1,077 грамма на миллилитр фиколла раствора под подвеской клетки с помощью ручной пипетки. После вращения при температуре 450 г в течение 30 минут при комнатной температуре, с низким или без перерывов, осторожно аспирировать супернатант, не нарушая гранулы клетки, как показано ранее.
Lyse красных кровяных телец путем повторного перерасхода гранул клеток в 20 миллилитров воды комнатной температуры. Смешайте осторожно, качая в течение 30 секунд. Немедленно добавьте 20 миллилитров 1,8% хлорида натрия и образца центрифуги при 450 г в течение 10 минут при комнатной температуре.
Тщательно аспирировать супернатант, как показано ранее. Аккуратно перерасходовать клеточные гранулы в двух миллилитровую комнатную температуру RPMI и поместить на лед. Считайте клетки с помощью гемацитометра.
Resuspend очищенных ПМН при концентрации один раз от 10 до 7 клеток на миллилитр с ледяной RPMI и держать на льду. Объедините 100 микролитров очищенных ПМН с 300 микролитров DPBS, содержащих один микролитер пятна йодида пропидия в двух цитометрии потока репликации труб. Для положительного контроля добавьте 40 микролитров раствора 0,5%Triton X-100 в одну из трубок цитометрии потока и тщательно перемешайте.
Используйте цитометрию потока для измерения рассеяния вперед, бокового рассеяния и окрашивания йодида пропидия для определения чистоты и целостности изолированных ПМН. Только PMN препараты, которые выше 98%чистый и выше 95%propidium йодид отрицательный должны быть использованы. Для протокола с изложением изоляции нормальной человеческой сыворотки, обратитесь к полной рукописи.
Подготовьте 96-хорошо пластины для PMN цитотоксиситности анализов, добавив 100 микролитров 20% изолированных человеческой сыворотки разбавленной DPBS для отдельных скважин, которые будут использоваться в этом анализе. Будьте уверены, чтобы включить по крайней мере один отрицательный контроль хорошо, что будет получать только средства массовой информации и по крайней мере один положительный контроль хорошо, что получит 0,05%Triton X.Incubate пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут. После инкубации дважды промывка закодированных колодцев 100 микролитров ледяного DPBS и поместите плиту на лед.
Удалите остатки DPBS из колодцев пластин и аккуратно добавьте 100 микролитров очищенных человеческих ПМН в один раз от 10 до 7-го ячейки на миллилитр к каждому закодированной скважине. Разрешить покрытием нейтрофилов, чтобы поселиться, оставив их на льду, по крайней мере пять минут до использования в следующих анализов цитотоксичности. В этом разделе описывается анализ, который количественно цитотоксии внеклеточных белков, вырабатываемых золотистым стафилококком против человеческих ПМН.
Культура S.aureus ночь в соответствующих средствах массовой информации с помощью встряхивания инкубатор установлен на 37 градусов по Цельсию за день до эксперимента. Субкультура S.aureus, выполняя от одного до 100 разбавления ночных культур бактерий со свежими средствами массовой информации. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с встряхивания, пока бактерии не достигнут ранней стационарной фазы роста.
После пяти часов роста перенесите один миллилитр субкультуры S.aureus в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку и центрифугу при температуре 5 000 г в течение пяти минут при комнатной температуре. После центрифугации, аспирировать супернатанты. Перейдите аспирированные супернатанты через фильтр шприца 0,22 микрона в новую микроцентрифугную трубку 1,5 миллилитров и поместите на лед.
Выполните серийные разбавления супернатантов с ледяными холодными средствами, используемыми для культуры золотистого стафилококка. Аккуратно добавьте образцы супернатантов или средств массовой информации, одолжив для отрицательного и положительного контроля отдельные скважины 96-хорошо пластины, содержащей ПМН на льду, как описано ранее. Аккуратно рок пластины для распределения supernatants в колодцах и инкубировать при 37 градусов по Цельсию.
В нужное время снимите тарелку с инкубатора и поместите на лед. Добавьте 300 микролитров ледяного DPBS, содержащих один микролитер йодида пропидия в каждую цитометрию потока трубки. Передача образцов для потока цитометрии труб на льду.
Для положительного контроля хорошо, добавить 20 микролитров 10%Triton X в образец до передачи в поток цитометрии трубки. Проанализируйте окрашивание йодида пропидия опьяненных ПМН с помощью цитометрии потока. В этом разделе описывается анализ, который количественно цитотоксии S.aureus после фагоцитоза человека PMNs.
Кривые роста, определяемые оптической плотностью на 600 нанометров и концентрацией бактерий, должны быть определены для соответствующих штаммов золотистого стафилококка перед использованием в этом анализе. Начните ночные культуры штаммов S.aureus и субкультурных бактерий, как описано ранее. После того, как субкультурный золотиной стафилококк достиг среднего экспоненциального роста, перенесите один миллилитр культурных бактерий в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку и центрифугу при температуре 5 000 г в течение пяти минут при комнатной температуре.
Вымойте S.aureus, аспирируя его супернатант, не нарушая гранулы и повторно гранулированных бактерий на один миллилитр DPBS. Вихрь образцов в течение 30 секунд. Центрифуга образцов при температуре 5 000 г в течение пяти минут при комнатной температуре.
Чтобы восполнять золотистую стафилококк, сначала повторно почерпню бактериальные гранулы в один миллилитр 20%человеческой сыворотки. Затем инкубировать образцы при 37 градусах по Цельсию с возбуждением в течение 15 минут. Вымойте воловизированный золотиной стафилококк после центрифугации, как показано ранее.
Разбавить волов золотистого стафилококка штаммов до одного раза от 10 до 8-й колонии формирования единиц, CFUs на миллилитр, с ледяной RPMI. Вихрь образца в течение 30 секунд и место на льду. Подтвердите концентрации золотистого стафилококка, используемого для этих анализов, покрыв от одного до 10 серийных разбавления бактерий на агаре.
Аккуратно добавьте 100 микролитров на колодец каждого штамма золотистого стафилококка, или RPMI для положительного и отрицательного контроля, к ПМН в 96-хорошо пластины на льду от шага 1,14. Аккуратно рок пластины для распространения золотия стафилококка в колодцах. Синхронизировать фагоцитоз с помощью центрифугирования пластины при 500 г в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия и инкубационой пластины при 37 градусах Цельсия сразу после центрифугации как нулевого времени.
В нужные моменты времени, положить пластину на лед и добавить 200 микролитров ледяной DPBS, содержащий один микролитер пропидия йодида для каждого потока цитометрии трубки затем передать образцы соответствующей трубки. Проанализируйте образцы для окрашивания йодида пропидия с помощью цитометрии потока, описанной в 2.8 и 2.9. Транскрипция двухкомпонентных лейкотоксинов, нацеленных на ПМН человека золотистого стафилококка, требует, чтобы компонентная система SA или S2 продемонстрировала полезность описанных анализов для количественной оценки цитотоксичности золотистого стафилококка против человеческих ПМН.
Эти эксперименты были проведены с клинически релевантнымзолом золотистого стафилококка, идентифицированным как USA300 в изологенном мутанте удаления SA или S в этом штамме. Левая панель изображает очищенные ПМН, а правая панель изображает в качестве примера намеренно загрязненные образцы. ПМН, изолированные с использованием процедур, описанных в разделе 1 этого протокола, были окрашены йодидом пропидия и исследованы с использованием цитометрии потока.
Участки форвардного и бокового рассеяния использовались для обнаружения загрязнения очищенных ПМН моноцитами или лимфоцитами в течение многих лет 1A и 1B. Целостность ПМН определялась с помощью окрашивания пропидия йодида. Используя описанный метод очистки PMN человека, мы можем последовательно изолировать пять раз от 10 до 7 до 1 раз от 10 до 8 ПМН, которые являются более чем 98%чистых и более 95%propidium йодид отрицательный.
Цитотоксия внеклеточных белков, производимых USA300 и мутантом AsaeR/S, была протестирована на очищенных ПМН. Эти эксперименты демонстрируют концентрацию зависимого увеличения пропидия йодида окрашивания очищенных ПМН после 30 минут интоксикации внеклеточными белками, производимыми USA300, но не с мутантом AsaeR/S. Дальнейшие эксперименты показали устойчивое увеличение доли йодида пропидида положительные ПМН после интоксикации США300 внеклеточных белков, которые плато примерно через 30 минут.
Минимальное окрашивание йодида пропидия человеческих ПМН было отмечено в любой момент времени после воздействия внеклеточных белков, вырабатываемых мутантом AsaeR/S. Наконец, была протестирована цитотоксичность США300 и мутант AsaeR/S против ПМН после синхронного фагоцитоза, концентрация зависимого увеличения доли пропидия йодида положительные ПМН наблюдалась через 90 минут после фагоцитоза USA300. Значительно меньше PMNs были propidium йодид положительный после фагоцитоза мутанта AsaeR/S.
Перечисление США300 и AsaeR/S мутантов инокулум был использован в каждом из этих экспериментов показали, что контраст в цитотоксичности между этими штаммами не из-за различий в концентрации бактерий, используемых. Этот протокол описывает очищение ПМН из человеческой крови в двух различных методах количественной оценки цитотоксии S.aureus против этих врожденных иммунных клеток. Успех этих процедур будет зависеть от качества очищенных ПМН и соответствующего приготовления бактерий золотистого стафилококка или супернатантов.
Пожалуйста, проконсультируйтесь с полным текстом рукописи для рассмотрения важных моментов при выполнении этих процедур. USA300 является вирулентным изолятом MRSA, и потеря AsaeR/S резко снижает транскрипцию факторов вирулентности, которые нацелены на ПМН человека, что делает эти штаммы идеальными моделями для сравнения цитотоксии с использованием описанных анализов. При использовании других штаммов золотистого стафилококка может потребоваться адаптировать условия роста, объемы добавленных супернатантов или отношение бактерий к ПМН.
