Создание протоколов трансфекции для видов эймерий будет способствовать продвижению изучения генных функций, разработке новых вакцин и скринингу новых целевых показателей в отношении лекарств для Эймерии. Используя этот метод, мы достигли трансфекции нескольких видов Эймерии, и нуклеофекция является полезным инструментом для облегчения применения генетических манипуляций у эймерианских паразитов. Нуклеофекция Эймерии дает рекомендацию для трансфекции других паразитов, которые не могут быть откоужденные в пробирке и ускорит изучение их генетических манипуляций.
Если вы попробуете этот метод в первый раз, вы должны хорошо подготовить все реагенты и их инструменты до начала трансфекции, чтобы избежать схватки во время эксперимента. Реализация этого метода помогает людям, которые сосредотачиваются на трансфекции Эймерии, увидеть сложные детали этого эксперимента. Для начала с высвобождением спороцистов, центрифуга один раз от 10 до семи спорулированных ойцист в растворе дихромата калия в 2300 раз г в течение пяти минут.
Вымойте их с PBS три раза. Переусердуйте гранулы с одним миллилитром PBS, и передать смесь в 15-миллилитровую трубку. Добавьте равный объем стеклянных бусин диаметром один миллиметр и потрохаться в подвеске oocyst с помощью вихревого миксера для выпуска sporocysts.
Каждую минуту следите за высвобождением спороцистов с помощью микроскопии. Когда более 90% oocysts сломаны, остановить вихри. Перенесите подвеску sporocyst на новые 1,5-миллилитровые трубки и центрифугу при 1600 г в течение пяти минут.
Повторное осаждение с одним миллилитром 50%плотность градиентного раствора, и центрифуга на 10000 раз г в течение одной минуты. Чтобы освободить sporozoites, resuspend осадок с excystation буфера, и инкубировать в 42-градусной водяной бане по Цельсию в течение 40 до 60 минут, чтобы освободить sporozoites. Встряхните трубки один раз в пять минут во время excystation.
Когда более 90% sporozoites освобождены, прекратить инкубацию. Центрифуга по 600 раз г в течение 10 минут. Повторное выпадение осадков с одним миллилитром 55%плотность градиентного раствора, и центрифуга трубки на 10000 раз г в течение одной минуты.
Resuspend осадков с одним миллилитром PBS, и рассчитывать sporozoites с помощью гемоцитометра. Чтобы собрать мерозоиты второго поколения Eimeria necatrix, вырезать куриный кишечник продольно от стебля желтка до илиеоцекалевого отверстия, и мыть его с PBS или HBSS осторожно три раза в чашке Петри. Разрежьте кишечник на кусочки и поместите их в коническую колбу с буфером пищеварения.
Поместите колбу на магнитный миксер при 37 градусах по Цельсию с перемешиванием бар в течение 30 до 60 минут, чтобы освободить мерозоитов. После 30 минут инкубации следите за высвобождением мерозоитов с помощью микроскопического исследования каждые пять минут. Чтобы очистить мерозоиты, залить суспензией, содержащей переваренные мерозоиты в течение четырех слоев марли, чтобы фильтровать в 50-миллилитровые трубки, и центрифугировать трубки при 600 раз г в течение 10 минут.
После центрифугации выбросьте супернатант, содержащий кишечник мусора. Перенесите осадки с очищенными мерозоитами на 1,5-миллилитровые трубки. Resuspend осадков с одним миллилитром PBS, и рассчитывать merozoites с помощью гемоцитометра.
Во-первых, центрифуга sporozoite или мерозоит подвески на 600 раз g в течение 10 минут. Затем отбросьте супернатант. В следующем порядке добавьте 85 микролитров буфера ядерной трансфекции, 10 микрограммов плазмиды и 25 единиц фермента ограничения в 1,5-миллилитровую трубку, содержащую сорозоиты или мерозоиты.
Перенесите подвеску на ядерную трансфекцию. Положите чашку в ядерный канавку передачи. Включите устройство нуклеофекции с помощью кнопки питания и выберите процедуру трансфекции U-033.
Когда программа закончится, нажмите кнопку X устройства нуклеофекции, и экран отображается нормально, указывая, что нуклеофекция успешна. Добавьте 0,5 к одному миллилитров модифицированной иглы Dulbecco's Medium в чашку нуклеофекции, чтобы остановить реакцию. После мягкого смешивания перенесите подвеску в 1,5-миллилитровую трубку.
Прививать нуклеофицированных паразитов в семидневных цыплят. Прививки мерозоитов Eimeria necatrix или sporozoites Эймерии тенелла через клоакал маршрут, но привить Eimeria acervulina sporozoites через внутривенные инъекции. После сбора ооцист из кала, используйте флуорессейн активированной сортировки клеток и 150 миллиграммов на килограмм пириметамина для увеличения трансгенного соотношения населения.
Этот протокол был использован для трансфектных эймерских паразитов. В этом исследовании, второе поколение меронтов и мерозоитов Eimeria necatrix показаны здесь, а также sporocysts и sporozoites Eimeria tenella после использования плотности градиентных растворов. Изображения oocysts Eimeria necatrix после заражения нуклеофицированными мерозоитами и ооцистами Eimeria tenella после заражения нуклеофицированными сполозоитами указывают на успешное нуклеофекцию.
Самое главное при попытке этой процедуры, чтобы убедиться, что очистка сорозоитов и мерозоитов являются успешными и использовать 50%плотность градиентного решения для удаления OS2, убедившись, что sporocysts и sporozoites более очищены. Следуя этой процедуре, вы можете оптимизировать этот протокол, такие как трансфектирующий oocyst или sporocyst, чтобы упростить процедуры трансфекции паразитов Eimeria в будущем. С развитием трансфекции в Эймерии, crispR-Cas9 технологии в Эймерии можно будет ожидать, чтобы значительно выдвинуть осторожные генетические манипуляции Eimeria и быть применены в качестве подходящего средства доставки вакцины.
