Этот протокол покажет вам, как испачкать микроглию, выполнить количественный анализ плотности и морфологии, а также количественно макрофаг инфильтрации в мозг. Этот метод позволяет исследователю измерять изменения в распределении микроглии и морфологии в количественном отношении и дифференцировать микроглии от проникновения макрофагов Этот протокол анализа может быть легко применен к другим моделям животных для измерения изменений в микроглиальной распределения и морфологии, где анти-IBA1 и анти-TMEM119 антител доступны. Настоятельно рекомендуется проводить количество клеток и следы, ослепленные экспериментальным состоянием, и быть последовательными в том, как эта процедура выполняется.
Чтобы начать эту процедуру, откройте программу обработки изображений, такую как Fiji или ImageJ, которая имеет ближайший сосед расстояние плагин установлен. Откройте изображение 20X, если шкала содержится в метаданных файла, а не автоматически устанавливается из метаданных. В баре меню выберите Analyze, Set Scale, а затем введите правильную информацию.
Чтобы установить шкалу вручную на основе шкалы, запечатленной на изображении, выберите инструмент «Прямая линия». Поместите курсор на край шкалы и при нажатии клавиши Shift нарисуйте линию как можно ближе к шкале на изображении. Выберите анализ, установите шкалу.
Окно всплывает и положить правильное известное расстояние и единицу длины, чтобы определить пиксель в длину единицы и нажмите OK. Далее выберите изображение, цвет, сделать композитный для создания композитного изображения всех каналов. В баре меню выберите Анализ, Установите измерения. Проверьте площадь, центроидов и периметр.
В меню Перенаправление для высадки выберите открытый файл, а затем нажмите OK. Перейти к изображению, цвету, каналу инструмент, чтобы открыть инструмент канала. Используйте инструмент Freehand Selection, чтобы нарисовать грубый периметр вокруг области интересов. Дважды нажмите Овальный инструмент на бар инструментов, чтобы включить инструмент выбора кисти.
Убедитесь, что поле Кисти Выбора Enable проверяется и нажмите OK. Используя кисть выбора, отрегулируйте периметр, чтобы наилучшим образом соответствовать области интереса, а затем нажмите T на клавиатуре по всей этой области, чтобы стрелка Y менеджера. Выберите анализ, измерение или нажмите клавишу M, и окно результатов будет всплывающее. Копировать и вставлять результаты в лист данных и сохранить информацию о области.
После копирования области, представляющих интерес, вы основой информации из окна Результаты, нажав на него и нажав на клавишу Backspace. Выберите окно ROI Manager, выберите трассу ROI и измените имя в нужное время, чтобы соответствовать имени изображения, нажав на Rename. Нажмите OK, а затем нажмите кнопку "Новое имя roi Trace" и сохраните.
Дважды нажмите на инструмент Brush в баре инструментов. Выберите черный цвет и размер кисти 10. Убедитесь, что опция Paint on overlay не проверена.
В канале TMEM119 аккуратно поместите черную точку в центр сомы для каждой положительной микроглии TMEM119. Поместите белую точку на центр клеток, которые не являются положительными для TMEM119. Повторите ту же процедуру для всех ячеек, содержащихся в области интересов.
Далее будут отображаться изображение, цвет, канал Сплит, окно для каждого канала. Определите канал, который имеет точечные аннотации, и закройте два других окна. Чтобы перенаправить новое изображение сплит-канала, перейдите на анализ, установите измерения.
В перенаправлении Чтобы отказаться от меню, выберите изображение сплит-канала и нажмите OK. Затем выберите Изображение, Тип, восьми-битный. Перейти к настройке изображения и выбрать порог. Отрегулируйте ползунки влево в обоих барах.
Это оставит только черные точки, которые теперь будут появляться белыми. Выберите область интереса в окне ROI Manager. В баре меню выберите Анализ, Анализируйте частицу.
В текстовом поле для размера ввемите от одного до 20. Коробка для единиц Pixel должна оставаться неконтролируемой, в то время как окно, которое для результатов отображения, суммировать и добавить к менеджеру должны быть проверены. Нажмите OK, чтобы отобразить окно Summary, которое даст количество очков.
Копировать и вставлять эту информацию на лист данных. Затем выберите плагины NND, чтобы показать окно NND. Каждое число представляет расстояние, которое каждая микроглия имеет до ближайшей соседней микроглии.
Копировать и вставлять всю эту информацию на лист данных. Вернитесь к окну Порога и отрегулируйте верхний ползунок вправо, который оставит все белые точки видимыми, теперь появляющимися белыми. Выберите анализ, анализ частиц для отображения окна analyze Particles.
Нажмите OK, чтобы показать окно Резюме, которое предоставляет количество очков. Копировать и вставлять эту информацию в лист данных. Перейдите к менеджеру по рентабельности инвестиций и выберите все баллы.
Затем нажмите правой кнопкой мыши и сохраните имя изображения. Это позволит сохранить все точки в файле qIP. Во-первых, откройте файлы изображений 4DX.
Всплывающее окно появится с просьбой, если изображения должны быть открыты в стеке. Нажмите OK. Далее выберите Изображение, Стеки, «Проект», чтобы открыть окно проекции. Включите все ломтики от первого до последнего ломтика.
Убедитесь, что максимальная интенсивность выбрана под тип проекции и нажмите OK. Нажмите на новое окно, которое содержит «Проект». Выберите изображения, цвета, сплит-каналы и проведите следы на изображениях канала IBA1. В баре меню выберите Анализ, Установите измерения.
Проверьте площадь, центроидов и периметр. В меню Redirect Чтобы отказаться от меню, выберите открытый файл и нажмите OK. Чтобы установить шкалу вручную на основе шкалы, запечатленной на изображении, выберите инструмент «Прямая линия». Поместите курсор на край шкалы и при нажатии клавиши Shift нарисуйте линию как можно ближе к шкале на изображении.
Выберите анализ, установите шкалу. Окно всплывает. Вввените правильное известное расстояние и единицу длины, чтобы определить пиксели на единицу длины и нажмите OK. Чтобы измерить размер сомы в канале IBA1, нарисуйте грубый периметр сомы с помощью инструмента Freehand Selection.
Дважды нажмите Овальный инструмент на панели инструментов, чтобы включить инструмент выбор кисти. Убедитесь, что поле Кисти Выбора Enable проверяется и нажмите OK. Используя кисть выбора, отрегулируйте трассировку, чтобы лучше всего соответствовать соме. Масштабирование позволит точность на этом этапе.
Далее нажмите клавишу T, чтобы добавить след сомы к менеджеру roi. Выберите анализ, измерение или нажмите клавишу M для отображения результатов. Копировать и вставлять эти результаты в лист данных.
Перейдите в окно ROI Manager, выберите область интереса и измените имя, чтобы соответствовать имени изображения, нажав rename. Нажмите правой кнопкой мыши на переименованном регионе, представляющих интерес, и нажмите Сохранить. Убедитесь, что имя указывает, что след для сомы и сохранить файл.
Для измерения площади арборизации в канале IBA1 сначала выберите инструмент Polygon Selection. Нажмите на микроглиальный процесс конечности с инструментом, чтобы начать форму полигона. Обоймите микроглию, нажав на кончики каждой конечности процесса, чтобы сформировать полигон, который наилучшим образом представляет область, покрытую микроглиальными арборизациями.
Когда полигон будет завершен, нажмите на отправную точку, чтобы закрыть его. Затем нажмите клавишу T, чтобы добавить след в roi Manager. Выберите анализ, измерение или нажмите клавишу M, чтобы добавить данные в окно Результатов.
Копировать и вставлять эти данные в лист данных. Чтобы сохранить информацию о области арборизации, перейдите в окно ROI Manager, выберите область интереса и измените имя, чтобы соответствовать имени изображения, нажав rename. Нажмите правой кнопкой мыши на переименованном регионе, представляющих интерес, и нажмите Сохранить.
Убедитесь, что имя указывает, что след для арборизации и сохранить файл. Это исследование описало пошаговый рабочий процесс для иммунофлюоресцентного совместного окрашивания IBA1 и TMEM119 и для анализа микроглиальной плотности, распределения и морфологии, а также инфильтрации периферических миелоидных клеток в ткани мозга мыши. Микроскопия флуоресценции используется для изображения совместной маркировки микроглии с помощью IBA1 и TMEM119 в корональной части спинного гиппокампа при увеличении 20X.
Успешное окрашивание показывает микроглиальные клеточные тела и их тонкие процессы. Окрашивание позволяет определить плотность и распределение микроглий, а также определить микроглиальные кластеры и проникновение макрофагов. Конфокальная микроскопия используется для изображения пошаговой процедуры отслеживания микроглиальной арборизации при увеличении 40X.
Эти репрезентативные результаты показывают положительные результаты IBA1 и TMEM119 положительные микроглии, а также пример отслеживания клеток тела. Важно быть последовательным при подсчете ячеек и обращать внимание на оба сигнала IBA1 и TMEM119. Этот метод позволяет исследователю определить области мозга, которые страдают от конкретного стимула, который затем может быть изучен более углубленно с дополнительными методами.
