Коллективная миграция клеток часто руководствуется градиентом сигнальных молекул. В этом видео мы демонстрируем, как количественно сотовых сил во время коллективной миграции руководствуясь биохимическим градиентом. Итак, мы интегрируем микрофлюидный чип с тракцией микроскопии, затем мы используем микрофлюидный чип для генерации биохимического градиента, и мы используем тракшн-микроскопию для измерения клеточной силы.
Доктор Хвансек Джанг, постград в моей лаборатории, продемонстрирует процедуру. Подготовьте решение PDMS, смешивая базовый еластомер и лечебный агент в соотношении 10 к одному. Поместите 15 миллилитров базового еластомера в 50 миллилитров конической трубки и добавьте 1,5 миллилитров лечебного средства.
Подготовь две из этих трубок. Vortex смеси PDMS в течение пяти минут до центрифугирования на 196 времени г в течение одной минуты, чтобы удалить пузырьки. Чтобы изготовить трафарет PDMS, налейте на пластину примерно один миллилитр смеси PDMS, избегая при этом СУ-8-узорчатых регионов, чтобы PDMS касалась боковых столбов Су-8, но не верхней части модели Су-8.
Поместите на плоскую поверхность в течение более 30 минут при комнатной температуре, а затем вылечить PDMS в сухой духовке при температуре 80 градусов по Цельсию в течение двух часов. Аккуратно снимите PDMS с формы СУ-8, обрежьте тонкую мембрану PDMS с помощью 14-миллиметрового полого пунша. Удалите пыль на поверхности частей PDMS с помощью липкой ленты перед автоклавом трафаретов PDMS.
Для изготовления микроканал PDMS, залить около 30 миллилитров смеси PDMS над СУ-8 плесени. Дега в течение 30 минут в вакуумной камере, а затем вылечить PDMS в сухой духовке при температуре 80 градусов по Цельсию в течение двух часов. Аккуратно снимите PDMS с формы Су-8 и разрежьте PDMS до 24 миллиметров на 24 миллиметра.
В каждом блоке PDMS, создать один выход и три входы с помощью одного миллиметра биопсии удар. Изготовление и силанизации стеклянных слайдов, как описано в текстовом протоколе. Обложка краями поверхности нижнего стекла с 100 микролитров связующего силанового раствора.
После выхода из стекла при комнатной температуре в течение одного часа, промыть стакан три раза с деионизированной водой. Затем дайте стеклу высохнуть при температуре окружающего воздуха или путем дует сжатый воздух. Подготовь решение по полиакриламинидного геля, как описано в текстовом протоколе.
Затем перенесите на 10 микролитров раствора смешанного геля на прямоугольный микроуэлл и поместите сверху круглую крышку. Исправить сборку пользовательского стекла, гель раствор, и крышка скольжения на крышке из шести хорошо пластины с липкой лентой и перевернуть его. Затем центрифуга в течение 10 минут при 96 раз g довести флуоресцентные частицы до верхнего слоя полиакриламинидного геля.
Снимите сборку с центрифуги и поместите ее на плоскую поверхность с крышкой скольжения вниз. Через 30 минут переверните сборку и поместите ее в 35-миллиметровую чашку Петри. Заполните блюдо двумя миллилитров деионизированной воды.
Используя типсы, аккуратно снимите крышку скольжения, сдвинув его в одну сторону. Чтобы кодировать коллаген на полиакриламинидный гель, растворить один миллиграмм на миллилитр сульфо-SANPAH в теплом 50 миллимолярный буфер HEPES. Брось 200 микролитров раствора на поверхность геля и активируйте ультрафиолетовым светом в течение 10 минут.
После УФ-активации, промыть гель два раза с 0,1 молярного буфера HEPES, а затем один раз с PBS. Код полиакриламинид гель с коллагеновым раствором при четырех градусах по Цельсию в одночасье. На следующий день, мыть гель три раза с PBS.
Погрузите автоматический трафарет PDMS в решение F-127. Держите его в 37-градусный инкубатор по Цельсию в течение одного часа. Вымойте трафарет PDMS с PBS три раза, и удалить жидкость из обоих трафарет PDMS и полиакриламинид гель.
Затем поместите трафарет PDMS на полиакриламидный гель и добавьте PBS в трафарет. Удалите пузырьки в отверстиях трафарета PDMS, мягко трубя. После удаления пузырьков, очистить PBS от поверхности трафарета PDMS.
Теперь добавьте 200 микролитров клеточного раствора на трафарет PDMS и поместите гель в инкубатор на один час, чтобы клетки прикрепляли к полиакриламиниду гель. После инкубации аккуратно смойте клеточный раствор средствами массовой информации культуры клеток и добавьте больше средств массовой информации культуры клеток. Снимите трафарет PDMS, проверьте образование клеточных островов под микроскопом.
Затем в течение 30 секунд обработать поверхность микроканалом PDMS кислородной плазмой. После удаления любой жидкости на полиакриламинид гель заполненные нижнее стекло, место PDMS микроканал на верхней части нижнего стекла, и положить сборку на пользовательский стеклянный держатель. Заполните микроканал средой клеточной культуры.
Для подготовки входных труб интегрированной микрофлюидной системы подключите обрезанную иглу и 30-сантиметровую мини-линию громкости с трехровным стопкоком. Подготовь три из этих механизмов. Для розетки трубки, подключите подстриженную иглу и 75-сантиметровую мини-линию громкости с трехрычиным стопкоком.
Заполните трубные линии средой, которая была разогрета в течение одного часа. Подготовка резервуаров путем удаления поршеней из шприцев и подключения входных труб линий. Подключите игольчатые разъемы каждой трубчатой линии в три бухты и одну розетку микрофлюидного устройства.
Заполните каждый резервуар тремя миллилитров свежей средней или кондиционированной среды. Для теста градиента заполните левый входный резервуар 20 нанограммами на миллилитр гепатоцитов, или HGF, в среде клеточной культуры. Для визуализации градиента концентрации добавьте 200 микрограммов на миллилитр флуоресцентного красителя в левый входный резервуар.
Подключите линию розетки к шприц-насосу. Поместите интегрированную микрофлюидную систему на стадию обычного эпифлюоресцентного микроскопа. Делать снимки каждые 10 минут в течение 24 часов с помощью автоматизированного микроскопа, размещенного в инкубаторе.
В каждый момент времени, принять набор изображений с помощью объектива 4X цели в трех различных каналах, в том числе фазовое изображение для визуализации миграции клеток, зеленый флуоресцентный образ для визуализации флуоресцентных бусин, встроенных в гель, и красное флуоресцентное изображение, чтобы визуализировать градиент концентрации химического вещества. После получения изображений замедленного действия влить 0,25%трипсин-ЭДТА раствор в микроканалы, чтобы отделить клетки от полиакриламинидного геля. После полного удаления клеток из геля, принять зеленый флуоресцентное изображение, которое будет использоваться в качестве эталонного изображения для тяги микроскопии.
Приступайте к анализу данных, как описано в текстовом протоколе. Для измерения контрактильной силы и межклеточного стресса, тракшн-микроскопия и микроскопия стресса монослой были объединены с микрофлюидным каналом. Карты были построены в радио координации с внешней тяги с использованием теплого цвета и внутренней тяги с использованием холодного цвета.
В нулевое время все острова показали аналогичные распределения тяги с сильной внутренней тягой на краю и колебаниями внутри острова. После 10 часов применения градиента HGF, в то время как степень расширения острова была разной в каждой колонке, распределение тяги было в значительной степени похоже на ноль времени. Средняя тяга не менясь в течение 10 часов.
Однако при расчете стресса монослоя каждая колонка показывала различные тенденции. Там, где концентрация HGF была низкой, средняя напряженность на островах сохранялась около 200 паскаль в течение 10-часового периода. Там, где концентрация HGF была высокой, средняя напряженность на островах постепенно снижалась с 230 паскаль до 100 паскаль в течение 10 часов, как показано ранее.
Там, где концентрация HGF была высокой на левой половине и низкой на правой половине острова, средняя напряженность сохранялась около 150 паскаль. Заполнение микрофлюидного канала должно быть нежным. Важно удалить пузырьки, попавшие в канал, одновременно не нарушая микро-родительских островов клеток.
Используя эту интегрированную систему, можно исследовать, как клеточный коллектив механически реагирует на различные химические градиенты, такие как химио-притягания или факторы роста. Эта платформа поможет нам в дальнейшем изучить механику коллективной миграции клеток под химическими градиентами, что является ключом к пониманием регенерации, метастазирования рака и развития.
