Наш протокол обеспечивает улучшенный метод проверки циркуляции химеризма и метод успешной установки модели парабиоза для биомедицинских исследований. По сравнению с существующими методами выявления химеризма крови при парабиозе, которые часто являются смертельными или громоздкими, наш протокол является безопасным и простым, что позволяет быстро и надежно проверить. Хотя этот метод специфичен для выявления химеризма крови в моделях парабиоза, он может быть применен к любым биомедицинским исследованиям, связанным с парабиотических процедур.
Наиболее сложным шагом является инъекция глюкозы. Поэтому не забудьте попрактиковаться в инъекциях хвостовой вены до выполнения экспериментальной процедуры, или использовать венозный визуальный фиксатор хвоста мыши. После подтверждения отсутствия реакции на педаль рефлекс, поместите два 20 до 25-граммовый анестезировал C57 черный 6 мышей мужского пола в положении на спине, и использовать электрическую бритву, чтобы тщательно брить левую сторону одной мыши и правую сторону второй мыши примерно с одного сантиметра выше локтя до одного сантиметра ниже колена.
Удалите оставшиеся волосы с помощью крема для депиляции, прежде чем делать продольные разрезы кожи в очищенной коже каждого животного, начиная от 0,5 сантиметра выше локтя до 0,5 сантиметра ниже коленного сустава, и аккуратно отсоедините кожу от подкожной фасции. Соедините олекранон и колено парабионта с 3-0 швом, и шов бритая кожа с непрерывным 5-0 шва. Затем подкожно вводят 0,5 миллилитров 0,9% хлорида натрия, чтобы предотвратить обезвоживание, и внутримышечно вводят 10 миллиграммов трамадола на 25 граммов мыши, чтобы облегчить боль, в каждую мышь в день в течение трех дней.
Чтобы проверить успешное строительство циркуляции между химеризмом между парабионтами по колебаниям глюкозы, на 10-й день после операции парабиоза, закрепите мышей-доноров в венозном визуальном фиксаторе хвоста мыши, и используйте 70-75%этанол-пропитанный шарик хлопка для того чтобы протереть caudal вены в фланге одного parabiont хвоста. Вставьте одноми миллилитровую шприц-иглу в хвостовую вену в два-четыре сантиметра от кончика хвоста и как можно параллельную вене, и ввимите один-два грамма на килограмм глюкозы в 100 микролитров солевого раствора донору в течение 10 секунд. Далее используйте ножницы, чтобы удалить руки от донора и реципиента животных, чтобы позволить сбор капли крови в разное время точки интереса после инъекции.
Затем добавьте каплю каждого образца крови в центр глюкометра тест-полоски для обнаружения уровня глюкозы. Чтобы проверить успешное строительство циркуляции Эванс синий краситель абсорбции, вводить 200 микролитров 0,5%Evans синий счетчик intraperitoneally в донорской мыши, и собирать кровь из обоих парабионтов путем сердечного прокола через два часа. Разделите сыворотку на центрифугу и перенесите сыворотку в коническую трубку для разбавления при соотношении 1 к 50 при 0,9% хлорида натрия.
Затем измерьте поглощение разбавленных образцов сыворотки на 620 нанометров на спектрофотометре. В этом репрезентативном анализе уровня глюкозы в крови у шести мышей-доноров уровень глюкозы в крови резко увеличился до 26,5 микромолара на литр в среднем через минуту после инъекции 100 микролитров глюкозы через хвостовую вену. Уровень глюкозы в крови затем постепенно снижается до 13,3 микролитров на литр в 60 минут.
У мышей-реципиентов уровень глюкозы в крови медленно увеличивался после инъекций, достигнув первого пикового уровня в 15 минут. Концентрация эвансового синего красителя в сыворотке парабионтов также указывает на успешное строительство циркуляционного химеризма, и можно было четко наблюдать подкожные сосудистые соединения между парабионтами. В парабионтах, которые не устанавливали химеризм крови через 15 дней после операции по парабиозу, мыши-реципиенты не проявляли повышенного уровня глюкозы в крови в течение 60 минут после инъекции глюкозы в донорское животное.
Концентрация в крови Эванс синий в двух получателей также не был повышен, демонстрируя, что метод колебания глюкозы является чувствительным, как Эванс синий метод. Кроме того, уровень инсулина в крови заметно снизился через час после инъекции глюкозы из-за быстрого повышения уровня глюкозы и восстановился до нормального уровня на три часа, что свидетельствует о том, что влияние вводимой глюкозы на метаболизм инсулина является ресториентным. Позаботьтесь, чтобы убедиться, что игла вставляется непосредственно в хвостовую вену.
После подтверждения химеризма крови парабионтов с помощью этого метода, физиопатологические изменения могут быть изучены в живых парабиотических животных.
