Основным преимуществом нашего генотипного протокола является то, что он сводит к минимуму загрязнение материнской ДНК, что является основной проблемой при генотипировании формалин-фиксированных, парафин-встроенных молярных тканей. Цитометрия потока является быстрым и недорогим методом, который значительно облегчает диагностику гидатиформных родинок. Для каждого формалин-фиксированный парафин-встроенный, или FFPE, продукт зачатия, подготовить четыре микрона толщиной гематоксилин и эозин пятно разделе, как подробно описано в этом видео для морфологической оценки микроскопии.
Поместите блоки FFPE на лед в течение 15 минут, чтобы облегчить раздел. Отрегулируйте микротом, чтобы сократить разделы, которые четыре микрона толщиной для микроскопической морфологической оценки. Поместите холодный блок в микротом и вырезать один раздел из каждого блока для Н И Е окрашивания.
Используя типсы, перенесите каждый участок на водяную баню по 45 градусов по Цельсию. Возьмите секцию из водяной ванны с положительно заряженным слайдом, ранее помеченным идентификационный номер образца с помощью карандаша. Поместите горки, содержащие секции, в духовку при температуре 65 градусов по Цельсию, чтобы секции придерживались слайдов.
Держите горки в духовке в течение 25 минут. Выполните Окрашивание H и E, погрузив слайды в соответствующие банки окрашивания в течение правильного периода времени, как у табулируется в текстовом протоколе. Намонтировать четырехмирные секции для морфологического анализа с монтажной средой.
И крышка стеклянной крышкой скользит. Используя слайды Н И Е и легкий микроскоп, выберите блок FFPE, который имеет наибольшее количество хорионических вилли. И если это возможно, блок, который имеет хорионические вилли отдельно от и не смешиваются с материнскими тканями.
Отрегулируйте микротом, чтобы вырезать разделы толщиной 10 микрон для извлечения ДНК. Вырезать от 10 до 30 разделов, в зависимости от количества хорионических вилли в блоке. После сбора разделов с слайдами, как и раньше, поместите слайды, содержащие разделы в духовке при температуре 65 градусов по Цельсию, чтобы позволить разделам придерживаться слайдов.
Держите горки в духовке в течение 20 минут. Выполните Окрашивание H и E, погрузив слайды в соответствующие банки окрашивания в течение правильного периода времени, как у табулируется в текстовом протоколе. Оставьте слайды под капотом дыма в течение как минимум трех часов для того, чтобы токсичные запахи ксилена рассеяться.
Используя типсы, вырвите крошечный лист бумаги из увлажненной бумажной салфетки. Под легким стерео микроскопом используйте типсы и мелкие кусочки увлажненной водой бумажных салфеток, чтобы соскребать все нежелательные материнские ткани с пятен H и E толщиной 10 микрон. Ключом к этому шагу является терпение, особенно для сложных блоков.
Важно также, чтобы кто-то другой взглянуть, чтобы убедиться, что не материнские ткани пропустили. Теперь, разорвать новый лист бумаги из увлажненной бумаги салфетки и использовать его для сбора хорионических вилли. Поместите кусочки бумажных салфеток с прикрепленным хорионическим вилли в помеченную трубку по 1,5 мл.
Свести к минимуму количество бумажных салфеток, используемых на этом этапе, как слишком много может засорить столбец извлечения ДНК и, следовательно, уменьшить окончательное количество собранной ДНК. Следуйте протоколу извлечения ДНК из комплекта FFPE для выполнения извлечения ДНК. Используя лабораторный спектрофотометр, загрузите 1 микролитр ДНК и измерьте абсорбанс в 216 нм для количественной оценки.
Загрузите 1 микролитер ДНК на гель 2%agarose и запустите гель электрофорез при напряжении от 80 до 100 вольт для качественной оценки. Основываясь на результатах оценки ДНК, выберите объем ДНК, который будет использоваться в мультиплексном коротком тандеме повторения усиления ПЦР. Цель использовать как минимум 1000 нанограммов ДНК.
Приступайте к усилению ПЦР, капиллярного электрофореза и анализа данных, как описано в текстовом протоколе. Чтобы выбрать идеальный блок FFPE, используйте слайды H и E на световом микроскопе, чтобы выбрать блок FFPE, который имеет от 50 до 70% своих тканей, состоящих из хорионических вилли. Для блоков, которые не имеют идеальное количество хорионических вилли, обогатить для хорионических вилли, как раздел выполняется.
Для этого определите, какая сторона свежесрезанной секции содержит больше хорионических вилли в соответствии с соответствующим слайдом Н И Е. Затем используйте лезвие, чтобы отрезать другую половину, которая должна быть отброшена для того, чтобы обогатить для хорионических вилли. Для выполнения секций наилучшего блока FFPE вырежьте четыре секции толщиной 50 микрон с помощью микротомы.
В случае, если идеальный блок FFPE не доступен, цель сохранить соотношение хорионических вилли материнской ткани, тем не менее. Например, если только 30% блока состоит из хорионических вилли, в то время как остальные материнские ткани, а затем удалить по крайней мере половину раздела, который содержит материнские ткани, и использовать больше разделов, чтобы компенсировать. Поместите секции в помеченные 15 мл труб.
Для депарафинизации и регидратации работайте в дымовом капоте, чтобы добавить каждый реагент и подождать соответствующий период времени, как уписаны в текстовом протоколе. Затем удалите реагент вакуумным всасыванием с помощью пипетки Pasteur. Затем добавьте четыре градуса цельсия цитрат раствора 15 мл труб.
После размещения в водяной бане 80 градусов по Цельсию в течение двух часов, дайте раствору остыть до комнатной температуры. Удалите раствор цитрата вакуумным всасыванием. Добавить шесть миллилитров 1x PBS, вихрь, и ждать одну-две минуты, чтобы ткани оседают на дно.
При необходимости центрифуга образцов при 1000 об/мин в течение 30 секунд. Удалите 1X PBS вакуумным всасыванием. Теперь добавьте один мл разогретого раствора пепсин и поместите в сухую ванну 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
Вихрь каждые 10 минут. Подготовка пропидий йодид рибонуклеазы решение в последние 10 минут этого инкубации. Добавьте еще шесть мл 1x PBS, вихрь, и ждать одну-две минуты, чтобы ткани оседают на дно.
Опять же, удалить 1x PBS вакуумным всасыванием. Добавьте 550 микролитров раствора рибонуклеазы propidium iodide A и поместите образцы в сухую ванну 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Используйте типсы, чтобы поместить пять см на пять см кусок 48 микрон фильтрационой сетки в верхней части полистирола круглые нижние трубки для использования с потоком цитометра.
Фильтровать раствор путем трубопроводов жидкости через сетку и в трубку. Образцы теперь готовы к запуску на цитометре потока. Держите их завернутые в фольгу, пока они не будут готовы к запуску.
Наконец, выполните цитометрию потока и анализ данных, описанный в текстовом протоколе. Микроспутник генотипирования частичной гидатидиформной родинки, наряду с ДНК пациента и ее партнера, показывает, что родинка пациента является триплоидной диспермией. Первый 1-й маркер показывает два пика в продукте зачатия.
Первый пик происходит от матери, так как только мать имеет пик такого размера. Следуя тем же рассуждениям, второй пик происходит от отца, так как он разделяет тот же аллель. Обратите внимание, как второй пик намного выше, чем первый, указывая, что Есть, вероятно, две дозы одного и того же отцовского аллеля в этом пике.
Материнское загрязнение является очень минимальным в этом продукте зачатия, потому что он отображает очень крошечный пик в положении второго материнского аллеля. Второй маркер показывает три пика в продукте зачатия. Два из этих пиков происходят от отца, и один от матери.
Третий и четвертый маркеры похожи на первый маркер, а также показывают два аллеля, поступающие от отца, и один от матери. В виду того что все 4 маркера последовательно показывают 3 аллеля, 2 возникая от отца и одного от матери, одно может заключить что этот продукт зачатия триплоид непермический и подтверждает диагноз частично моль. Для интерпретации результатов генотипирования важно знать уровень загрязнения на основе заметок, сделанных во время очистки.
В некоторых случаях мы не можем прийти к выводу, следуя этим двум методам. В таких случаях мы используем другие методы, такие как FISH, чтобы раскрыть истинные генотипы. Микроспутник генотипирования позволил точной диагностики моляров и проложил путь, чтобы лучше понять генотипы, которые связаны с различными особенностями hydatidiform родинок.
