Разработка селективных генов и инструментов доставки лекарств для лечения нейродегенеративных расстройств требует количественной оценки и характеристики клеточных таргетингов при повторном введения, вирусных векторах или наночастицах. Они имеют пропускную способность и мультиплексирование возможностей цитометрии потока, позволяет простой и одновременной идентификации нескольких типов клеток из мыши мозга и спинного мозга. Демонстрацией процедуры будет Франсиско Хавьер Молина Эстевес, пост-док из Александровой лаборатории.
После сбора урожая головного и спинного мозга из восьминедельного C57 Черный 6 мыши, поместите ткани в отдельные колодцы из шести скважин пластины, содержащей два миллилитров ледяной HPSS на скважину на льду. Разделите каждую собранную ткань на две равные части. И использовать ножницы, чтобы фарш одну половину каждого образца ткани в один-два миллиметра толщиной штук.
Когда все ткани были фрагментированы, предварительно промыть модифицированный 1000 микролитров пипетки наконечник в HPSS, и использовать пипетку для передачи каждой ткани подвески в отдельных 15 миллилитров конических труб. Промыть скважины дополнительными двумя миллилитров HPSS на скважину. И потяните моет в соответствующих 15 миллилитров конических труб.
Осадок образцов центрифугации. И смешать 50 микролитров фермента P из комплекта диссоциации нервной ткани с 1900 микролитров Buffer X из комплекта на образец. Разогреть смесь фермента при 37 градусах по Цельсию, по крайней мере 10 минут.
И аспирировать супернатант из каждой трубки сбора тканей. Когда ферментная смесь будет готова, добавьте в каждый образец 1,95 миллилитров раствора. И осторожно вихрь, чтобы вновь приостановить гранулы.
Затем инкубировать образцы на колесе в течение 15 минут при 37 градусах по Цельсию, и смешать 10 микролитров фермента А с 20 микролитров буфера Y на образец. Довозить второй ферментный раствор при 37 градусах по Цельсию, прежде чем добавить 30 микролитров раствора в каждый раствор ткани в конце встряхивания инкубации. Используйте наконечник пипетки из 1000 микролитров, предварительно промытый HPSS, чтобы аккуратно смешать каждый образец.
И вернуть образцы в колесо в течение 15 минут при 37 градусах по Цельсию. В конце инкубации, арест энзиматических реакций с 10 миллилитров ледяной HPSS. И осадок образцов центрифугации.
В конце центрифугации повторно приостанавливайте гранулы в семи миллилитров ледяной HPSS на трубку. И аккуратно вихрь каждого образца, прежде чем держать трубки на льду. Для гомогенизации тканей добавьте три миллилитров предварительно охлажденного HPSS в предварительно охлажденный стеклянный раствор мясорубки ткани dounce и перенесите вторую половину одного из собранных образцов ткани головного или спинного мозга в раствор.
Аккуратно macerate ткани с 10 ударов Pestle A, а затем 10 ударов Pestle B.And передачи гомогенизированной смеси в новую 15 миллилитров конической трубки. Заполните трубку до конечного объема в 10 миллилитров с предварительно охлажденной HPSS для центрифугации. И повторно приостановить гранулы в семь миллилитров свежих HPSS с вихрем, прежде чем держать образец на льду.
Для удаления мусора добавьте три миллилитров предварительно охлажденного раствора изотонического Percoll к каждому переваренного или гомогенизированного образца. И осторожно вихрь образцов, чтобы убедиться, что они однородно смешанные. Далее центрифуга проб, и тщательно удалить беловатый диск мусора и миелина плавающей на поверхности раствора.
Когда мусор был выброшен, собрать все, кроме последних 100 микролитров супернатанта из каждой трубки, не нарушая гранулы. Повторно приостанавливайте каждую гранулу в один миллилитр раствора FACS BL для переноса в отдельные 1,5 миллилитровые микроцентрифуговые трубки. После этой интеграции с раствором Percoll, важно, чтобы удалить диск мусора и supernatant очень тщательно, не вытесняя гранулы клетки, чтобы избежать потери образца.
После центрифугации тщательно аспирируют супернатант из каждой трубки и повторно приостанавливают гранулы в 350 микролитров свежего FACS BL на трубку. Для цитометрического анализа потока изолированных типов клеток, инкубировать образцы с пятью микрограммами на миллилитр блока FC на трубку в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию, прежде чем добавить соответствующие антитела к каждой трубке в соответствии с протоколом стоя, изложенным в таблице. Vortex каждой трубки в течение пяти секунд, чтобы смешать.
И поместите образцы на четыре градуса по Цельсию в течение 15 минут защищены от света. В конце инкубации вымойте образцы одним миллилитром PBS на трубку и центрифугой. Повторно приостанавливайте гранулы в соответствующем объеме стрептавидина на трубку.
После вихря, чтобы смешать, инкубировать образцы в течение 10 минут при четырех градусах цельсия защищены от света. И мыть клетки с одним миллилитров PBS на трубку, как попродемонстрировано. После отказа от супернатантов, повторно приостановить гранулы в 300 микролитров свежих FACS BL на трубку.
И маркировать каждый образец пятью микролитров 7-AAD. Затем храните образцы при четырех градусах цельсия, защищенных от света до цитофторометрического анализа. Метод гомогенизации производит более высокую урожайность клеток из мозга и спинного мозга в целом, но большинство клеток, извлеченных, как правило, мертвы, в результате чего только и примерно 14%исцелил жизнеспособных клеток из мозга, и примерно 10%исцелил из спинного мозга.
В отличие от этого, метод пищеварения папаина приводит к общему лучшему сохранению клеточной жизнеспособности. Анализ суспензий клеток головного и спинного мозга с девятицветной цитометрией би-потока, показывает наличие CD45-CD11b-microglia и макрофагов. И CD45-CD11b-лимфоциты в обеих тканях.
Популяции CD45-клеток могут быть дискриминированы в зависимости от их положительности для астроцитов, или олигодендроцитных маркеров, или ферионального и эндотелиального выражения маркера поверхности. Используя метод гомогенизации, от 32 до 38% жизнеспособных клеток имеют гематопоэтическое происхождение. В то время как метод энзиматичного пищеварения приводит к приобретению очень большой доли негематопоэтических CD45-клеток.
Примечательно, что CD45-CD11b-microglia и макрофаги представляют собой наиболее распространенных жизнеспособных клеточных фракций с методом гомогенизации. Метод пищеварения, однако, производит более неоднородное представление типов клеток, включая астроциты, олигодендроциты, эндотелиальные клетки и нейроны. Этот протокол является универсальным и может быть использован для нескольких приложений ниже по течению, таких как количественная оценка или изоляция конкретных субпопуляций клеток, первичная культура, или биохимический, или анализ секвенирования РНК.
Мы внедрили этот протокол для оценки экспрессии генов и функциональных подписей различных популяций ЦНС во время этой прогрессии, или после лечения в мышиной модели эндотрофического бокового склероза.
