Микрофизиологические системы имеют способность эмулировать фармакокинетическую и токсикологическую реакцию организма человека на конкретные методы лечения интересов. Микрофизиологические системы могут заменить тесты на животных, поскольку их использование может улучшить прогностическую мощность методов in vitro и снизить стоимость и время фармакокинетических и токсикологических исследований. За 24 часа до введения испытательного вещества, разделить 800 микролитера aliquot Уильяма ES среды между большими и меньшими отсеками двух чип органов, и аспирировать базолатеральной и апиальной среды от каждого кишечного барьера эквивалент в подготовленных 24 пластины хорошо.
Используя стерильные типсы, интегрируйте одну вставку на две цепи чипа органа в более большой отсек и добавьте 200 микролитров DMEMS в апиальную сторону. Используя широкие наконечники скважины, интегрируйте 20 эквивалентов печени на цепь в меньший отсек двух чипов органов и подключите систему к блоку управления. Затем подключите блок управления к под давлением подачи воздуха и установить давление примерно плюс-минус 300 баров и частоты перекачки 0,3 Герц.
На следующий день разбавить бульон ацетаминофен раствор 12 микромоляных концентрации. Чтобы заменить среду в системе, аспирировать базолатеральные и апические средства массовой информации из эквивалента кишечного барьера в двух органных чипов и добавить 500 микролитров свежей соответствующей среде культуры в большой отсек на органоидной базолатеральной стороне и 300 микролитров в небольшой отсек. После проверки на пузырьки, эмулировать устное введение с добавлением 200 микролитров 12 микромоляных ацетаминофен решение на апической стороне кишечной культуры вставки и подключить микрофизиологическую систему к блоку управления.
Соберите общий объем как с кишечной апиальной, так и с базолатеральной сторон, а также из небольшого отсека в тройном в указанные моменты времени. Когда все образцы будут собраны, установите все соответствующие параметры для анализа HPLC, как указано в таблице, и отфильтруй мобильный этап через мембранный фильтр 0,4 микрона в вакууме. Затем отфильтруйте образцы через фильтр для шприца PVDF размером 0,22 микрона и храните образцы во флаконе перед началом УФ-измерения HPLC.
Чтобы оценить жизнеспособность органоидов, перенесите все 20 сфероидов из каждой репликации в отдельные скважины пластины из 96 скважин и перенесите вставки клеточной культуры в отдельные скважины пластины из 24 скважин. Вымойте эквиваленты тканей три раза со свежим DPBS за стирку и добавьте 300 микролитров по миллиграмму на миллилитр MTT раствор для каждой экспериментальной хорошо. После трехчасовой инкубации в инкубаторе клеточной культуры замените раствор МТТ на 200 микролитров изопропанола на колодец для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия для извлечения МТТ-formazan из кишечника и эквивалентов печени.
На следующее утро перенесите 200 микролитров каждого супернатанта в соответствующий колодец в пластине 96 хорошо и прочитайте formazan на считыватель пластины на 570 нанометров, чтобы позволить расчет относительной способности клеток уменьшить МТТ, используя среднюю оптическую плотность каждой точки времени по сравнению с отрицательным контролем. Для цитохимического и гистологического анализа образцов, сначала исправить кишечника и печени эквиваленты в 4%paraformaldehyde в 0,1 моляра PBS в течение 25 минут при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть органоиды пять раз в PBS в течение 10 минут за стирку, прежде чем окрашивание кишечных и печеночной эквивалентов с тетраметилродамина изотиоцианата фаллоидин Alexa Fluor 647 фаллоидин в течение одного часа при комнатной температуре.
В конце инкубации перенесите образцы в замораживание среды в течение нескольких минут, прежде чем оснастки замораживания тканей в жидком азоте. Далее, используйте криостат, чтобы приобрести от 10 до 12 микрон толщиной печени сфероидных крио-секций и смонтировать секции тканей в монтажной среде с DAPI для визуализации с помощью конфокальная флуоресценция микроскопии. Для митохондриального и ядерного окрашивания, полностью покрыть образцы с митохондриальным раствором окрашивания для 15 до 45 минут инкубации при 37 градусах по Цельсию во влажной атмосфере с 5%carbon dioxide.
В конце инкубации, тщательно заменить окрашивание раствор с 2 до 4%paraformaldehyde в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре. После фиксации, осторожно промыть клетки два раза со свежим PBS в течение пяти минут за стирку перед маркировкой образцов с нуклеиновой кислоты окрашивания рабочего раствора в течение 10 минут при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть образцы с тремя, пять минут моет в PBS защищены от света, и использовать нуклеин кислоты пятно для облегчения количественной оценки числа митохондриальных пятен, выражаюющих клетки на флуоресцентный микроскоп с соответствующими наборами фильтра.
Интеграция кишечного барьера человека и эквивалента печени в микрофлюидное устройство с двумя органными чипами позволяет оценить фармакокинетические и токсикологические свойства лечения, представляющие интерес. После лечения образцы мультимедиа могут быть проанализированы HPLC. Органоиды могут быть проанализированы на их экспрессию генов, трансэпителиальные значения электрической резистентности, а также экспрессию и активность белка, а также на их морфологические характеристики.
Анализ MTT может быть выполнен для оценки органоидной жизнеспособности, а также для обнаружения очень ранних токсичных событий в ответ на лечение ацетаминофеном. Поток средств массовой информации не влияет на поглощение ацетаминофена, в то время как он значительно улучшает функцию эквивалента печени, указывая, что поглощение ацетаминофена человека и печеночная метаболизм могут быть эмулированы в этой микрофизиологической системе. Микрофизиологические системы могут заменить модели животных в разработке и открытии лекарственных препаратов, поскольку они лучше имитируют физиологию человека и могут использоваться для содействия разработке лекарственных препаратов с более высокой скоростью и более низкими ценами на риск и сложность.
