Этот протокол показывает, как использовать кишечные органоиды, полученные из биопсии, и технологию «орган на чипе» для создания физиологически значимого чипа кишечника, который затем может быть использован для прогнозирования фармакокинетики и лекарственного взаимодействия, а также для изучения дисфункции кишечного эпителиального барьера. Объединение органоидов в технологии «орган на чипе» позволяет воспроизвести сложность кишечного эпителия. Кроме того, это позволяет лучше экспериментально контролировать механические сигналы, распределение потока и биохимические градиенты.
Этот метод имитирует сложную физиологию кишечника человека, давая более глубокое понимание клеточной и молекулярной основы нормальных и патологических функций кишечника. Это помогает лучше прогнозировать фармакокинетику и фармакодинамику, а также потенциальные кандидаты на лекарства для предотвращения воспалительных повреждений. Посев является критическим шагом в протоколе.
Чрезмерная фрагментация или неточная плотность посева кишечных органоидных фрагментов могут поставить под угрозу развитие и дифференцировку эпителиального барьера. Для начала аспирируйте среду из статической органоидной культуры. Извлекайте среду из достаточного количества скважин для достижения конечной плотности посева в восемь миллионов клеток на миллилитр.
Добавьте 500 микролитров ледяного раствора диссоциации BMM в каждую скважину и прикрепите солюбилизированный BMM к поверхности скважины. Соберите суспензию в 15-миллилитровую трубку с низким содержанием белка и поместите ее на лед. Осторожно встряхивайте тюбик каждые 15 минут в течение одного часа.
Центрифуга в 300 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия для получения органоидной гранулы. Если над гранулой наблюдается прозрачный слой геля, раствор аспирата из тюбика. Повторно суспендировать гранулу и добавить равный объем диссоциационного раствора БММ.
Инкубировать на льду в течение 10 минут и центрифугировать. Повторять до тех пор, пока не появятся солюбилизированные остатки BMM. Затем выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах раствора органоидного пищеварения.
Инкубируйте трубку при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной-трех минут и добавьте восемь миллилитров усовершенствованного DMEM F12, чтобы остановить ферментативную реакцию. Центрифугируйте и повторно суспендируйте гранулу в полной органоидной среде роста, чтобы достичь восьми миллионов клеток на миллилитр. Aliquot 360 микролитров в стерильных 1,5 миллилитрах низкобелковых связывающих трубках.
Далее снимите среду с верхнего канала покрытых стружкой и добавьте 30 микролитров клеточной суспензии. Инкубируйте чипы при температуре 37 градусов цельсия в течение ночи, чтобы приклеить фрагменты органоидов к мембране. Добавьте три миллилитра предварительно уравновешенной полной органоидной питательной среды к верхнему впускному резервуару и три миллилитра предварительно уравновешенной среды роста эндотелиальных клеток в нижний входной резервуар.
Добавьте 300 микролитров той же среды в соответствующие верхние и нижние выпускные резервуары. Перенесите лоток с переносными модулями в модуль культуры. На модуле культуры многократно запускайте основной цикл до тех пор, пока не образуется достаточное количество капель для успешного соединения чипов.
Затем вставьте держатель чипа в портативный модуль. Затем запустите двухчасовой цикл регулирования для создания давления на питательные среды в портативном модуле и чипе, после чего запрограммированные условия возобновятся. Затем измените параметры растяжения и запустите модуль языка и региональных параметров.
Через 24 часа повторите цикл с 10% растяжением и той же частотой. Для приготовления дозирующей среды или контроля транспортного средства разбавляют растворы индуктора CYP или ДМСО в полной органоидной среде роста и среде роста эндотелиальных клеток. Приостановите модуль культуры и поднесите лотки в шкаф биобезопасности.
Замените среду во всех входных и выходных резервуарах двумя миллилитрами дозирующих сред с индукторами или управлением транспортным средством. Верните портативные модули обратно в модуль культуры и перезапустите поток со скоростью 30 микролитров в час. Заменяйте среду свежеприготовленным индуцирующим раствором каждые 24 часа и продолжайте культивирование в течение 48-72 часов.
Затем поднесите лотки в шкаф биобезопасности и аспирируйте дозирующую среду из всех резервуаров. Промыть и заменить верхний входной резервуар теплой усовершенствованной средой DMEM F12, а нижний резервуар средой для роста эндотелиальных клеток. Замените промывочную среду одним миллилитром раствора подложки зонда.
Перфьминируйте стружку с высокой скоростью потока 1000 микролитров в час в течение пяти минут и аспирируйте как верхние, так и нижние выпускные резервуары. Верните чипсы в модуль культивирования и инкубируйте в течение одного часа при постоянном потоке 300 микролитров в час. После одного часа обработки остановите поток и отнесите лотки в шкаф биобезопасности.
Соберите 100 микролитров сточных вод из верхнего выходного резервуара и добавьте его в трубку, содержащую 200 микролитров стоп-раствора. Поместите трубки сразу на сухой лед и храните образцы при минус 80 градусах Цельсия. Промывайте оба канала 200 микролитрами стерильного DPBS.
Затем заблокируйте выпускное отверстие нижнего канала с помощью наконечника пипетки фильтра 200 микролитра. Перфьюировать 50 микролитров диссоциационного раствора через нижний канал и инкубировать в течение двух минут при комнатной температуре. Обеспечить полное отсоединение эндотелиальных клеток и удалить диссоциационный раствор из канала путем пипетки.
Повторите стирку. Затем заблокируйте выход верхнего канала и перфьминируйте 75 микролитров буфера лизиса белка. Оставьте наконечник пипетки вставленным и высиживайте в течение пяти минут при комнатной температуре.
Соберите лизаты клеток в 1,5-миллилитровую трубку, пипетировав от пяти до 10 раз. Повторяют перфузию и сбор для получения полного отслоения клеток и хранят лизаты при минус 80 градусах Цельсия до анализа. Для лизиса РНК следуйте той же процедуре, используя 150 микролитров буфера лизиса РНК.
Сначала готовят раствор для дозирования гамма-интерферона путем разбавления исходных растворов в дегазированной среде роста эндотелиальных клеток. В шкафу биобезопасности удалите среду из нижнего канала впускных резервуаров и замените ее тремя миллилитрами дозирующего раствора ежедневно. Затем поместите лотки в модуль культивирования и перфьминируйте чипсы с высокой скоростью потока 1000 микролитров в час в течение пяти минут.
Переключите расход на 60 микролитров в час и продолжайте текучую культуру. Добавьте 100 микролитров DPBS на скважину в 96-луночную черностенную пластину. Используя многоканальную пипетку, добавьте 50 микролитров сточных вод из всех резервуаров в соответствующие скважины.
Для подготовки стандартной кривой выполняют трехкратное разведение среды, содержащей 100 мкг на миллилитр трех килодалтон декстран каскадного синего цвета в DPBS. Затем выполняют серийный бред с помощью трехкратного разведения среды роста эндотелиальных клеток в DPBS. Отчетливые морфологические особенности чипов двенадцатиперстной кишки и толстой кишки были подчеркнуты наличием ворсинчатых образований в чипе двенадцатиперстной кишки, представляющих архитектуру тонкой кишки.
В чипе двенадцатиперстной кишки, подвергшемся воздействию индукторов цитохрома P450 рифампицина и витамина D3, наблюдалась повышенная экспрессия гена мРНК для препарата, метаболизирующего фермент цитохрома P450 3A4, и повышенная каталитическая активность фермента цитохрома P450, что указывает на соответствующие индукционные реакции у всех трех доноров органоидов. При обработке эпителиального монослоя чипа толстой кишки интерфероном гамма наблюдалась нарушенная морфология клеток и потеря столбчатого эпителия. Кроме того, лечение интерфероном гамма приводило к увеличению цитоплазматического сигнала белков плотного и адгезивного соединения по сравнению с контролем транспортного средства, показывая смещение маркеров плотного соединения ZO-1 и клаудина 4 и интернализацию окклюдина и E-кадгерина.
Значительное увеличение эпителиальной параклеточной проницаемости наблюдалось после 48 часов гамма-стимуляции интерфероном на чипах толстой кишки. Аналогично, интерферон гамма индуцирует активацию апоптоза, о чем свидетельствует увеличение внутриклеточного содержания расщепленной Каспазы 3. Интерферон гамма индуцировал поляризованную секрецию провоспалительных молекул в чипе толстой кишки, о чем свидетельствует базолатеральная секреция VCAM-1 и интерлейкина-6 и апикальная секреция ICAM-1 и сывороточного амилоидного белка A. Для успешной культуры чипа кишечника следует использовать недифференцированные органоиды и следовать инструкциям по фрагментации и плотности посева.
После успешного создания кишечного чипа мы можем изучать кишечное всасывание, транспорт и метаболизм, уровни питательных веществ и секрецию кишечных гормонов, взаимодействие патогенов микробов хозяина, безопасность и эффективность лекарств, механизмы заболевания для конкретного пациента и реакции на терапию.
