Этот протокол позволяет маркировать отдельные эпендимоглиальные клетки в теленцефалоне зебры, чтобы обеспечить их долгосрочный мониторинг, а также манипуляции конкретных путей в клеточно-автономной манере. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет одноклеточной маркировки в быстрый и эффективный способ, а также редактирования генов и сигнализации пути манипуляции в клеточно-автономной манере. Этот метод позволяет изучат основные вопросы клеточной биологии, например, о делеминации клеток, поддержании эпителиального гомеостаза и симметрии деления клеток.
Начните с использования иглы вытягивания аппарата для подготовки стеклянных капилляров. Используйте советы микрозагрузчиков, чтобы заполнить подготовленный стеклянный капилляр десятью микролитров плазмидного раствора. Затем нажмите меню изменить капилляр "на инъекционное устройство, чтобы игла, чтобы быть загружены в держатель иглы.
Затем переключитесь с устройства впрыска с капилляра на режим впрыска. Затем, используя стереомикроскоп с четырехкратным увеличением, и Finden типсы, вырезать только кончик капилляра. Затем нанесите давление на педаль стопы, чтобы подтвердить, что плазмидные растворы легко выбегает из иглы без помех.
Когда игла будет готова, перенесите зебру из резервуара для мужа в контейнер обезболивающего раствора. И подождите несколько минут, пока движение жабры утихнет. Нажмите на соленую рыбью спинную сторону вверх на предварительно смоченной губкой под стереомикроскопом, и используйте микронойф из нержавеющей стали с 40-миллиметровым передним краем и толщиной 0,5 миллиметра, чтобы тщательно создать небольшое отверстие в черепе рыбы на задней стороне теленцефалона, рядом с границей оптического тектума.
Наклоните рыбу по мере необходимости и сориентировать кончик стеклянной капиллярной кости к черепу в правильном углу, чтобы облегчить проникновение капиллярного кончика через отверстие. Затем очень осторожно вставьте кончик капилляра в отверстие через спинной эпендимальный клеточный слой, пока он не достигнет теленцефалического желудочка, и нанесите давление на педаль стопы в течение примерно 10 секунд, чтобы доставить примерно 1 микролитер плазмидного раствора. Успех доставки может быть подтвержден путем наблюдения за распространением зеленой жидкости по всему желудочков.
Обложка рыбы теленцефалон с небольшим количеством ультразвукового геля. Для электропорации плазмидного инъекционного животного снимите губку с инъекционной настройки и погрузите внутреннюю сторону электротипса в ультразвуковой гель. Располагайте головку рыбы между электродами, с положительным электродом на брюшной стороне головы и отрицательным электродом на спинной стороне.
Затем, все еще держа тело рыбы в губке, нажмите электроды осторожно и точно против теленцефалона и управлять током с педалью ноги, удерживая электроды на месте, пока все пять импульсов не будут закончены. Если электропорация успешна, плазмид помечены одной эпендимоглиальных клеток можно наблюдать среди неплазмидных помечены эпендимоглиальных клеток. В зависимости от эффективности процесса электропорации, может быть помечено более высокое или меньшее количество эпендимоглиальных клеток.
Тем не менее, продемонстрированый протокол дает большее количество помеченных ячеек, чем ранее опубликованные протоколы. Обратите внимание, что самая высокая плотность помеченных клеток, как правило, возникают в основном на внутренней желудочковой стороне обоих полушарий из-за того, как впрыскиваемая плазмидная жидкость распределяется между полушариями. В этом видео, одно полушарие теленцефалона зебры представлено в 3D, где эпендимоглиальные клетки с радио-процессами, находятся в пурпурном при наблюдении со стороны.
Благодаря совместной электропорации с другой плазмидой, которая маркирует ядра, можно наблюдать деление клеток эпендимоглиальных клеток. Неудачное электропорация приводит к очень низкому количеству или без помеченных эпендимоглиальных клеток. Спинные эпендимальные клетки, однако, скорее всего, будут помечены.
Их сома больше в кубоиды, и они не обладают радио-удлиненные процессы, как видно из стороны зрения эпендимоглиального слоя клеток. TdTomato-mem помечены клетки, скорее всего, эпендимальные клетки, которые расположены над слоем ependymoglia. В отличие от этого, введение tdTomato-mem, выражаюго плазмиду отдельным эпендмиоглиальным клеткам, приводит к выражению tdTomato-mem в дополнение к первоначальной маркировке клеток.
Наиболее важные вещи, чтобы помнить, чтобы сократить только кончик капилляров и проникнуть в эпендимальный слой во время инъекций, так что жидкость распространяется по всему желудочка. Этот метод позволяет осуществлять долгосрочный мониторинг одиночных эпендимоглиальных клеток с помощью визуализации in vivo и, следовательно, устанавливать их роль в регенерации мозга, а также их обширную генетическую связь in vivo.
