Микроаррей антигена гриппа позволяет одновременно измерять несколько изотипов антител против более чем 300 штаммов гриппа из небольшого объема образца крови всего одного микролитора. Микроаррей облегчает высокопропутное измерение широты антител к гриппу в антигенном ландшафте штаммов гриппа. Характеризовав антитела гриппа более подробно, чем это было возможно ранее, этот микроаррей может помочь определить, почему у некоторых людей развивается инфекция гриппа, а у других нет.
Метод антигенного микроаррея был применен к 35 различным патогенам в нашей лаборатории, что позволяет измерять антитела против 60 000 антигенных мишеней и от 50 000 образцов сыворотки, собранных из случаев инфекционных заболеваний и здорового контроля во всем мире. Обустив эту технику через сша семинары, мы обнаружили, что возможность визуально продемонстрировать технику имеет решающее значение для ее понимания и производительности. Демонстрацией процедуры будут Аль-Ясинскас и Рафаэль де Ассис, ученые проекта из нашей лаборатории.
Для печати антигенов с помощью принтера microarray, выберите принтер с низким объемом microarray кровянистые пятна булавки, которые могут аспирировать антигены из 384-хорошо источник пластины в образец канала и депозит антигенов через прямой контакт и капиллярное действие на 16 площадку нитроцеллюлозы покрытием стеклянные слайды. В программном обеспечении для печати введите количество образцов пластин, которые будут использоваться в номере текстового ящика пластин, и выберите тип пластины, который будет использоваться для анализа. Выберите конфигурацию пин-кода и установите происхождение смещения на расстояния между происхождением слайда и местом, где печатные штыри начнут печатать на слайдах.
В соответствии с вкладкой проектирования массива определите размер и форму массивов и выберите параметры того, как печатные штыри будут подбирать и распределять образцы. Настройте протоколы очистки штыря и определения последовательности, в которой блоки образца печатаются на слайдах. Программное обеспечение массива будет строить аннотированный файл индекса сетки, чтобы описать расположение антигенов в каждом микроармей.
После программирования печатного программного обеспечения с желаемым протоколом, запустите тираж. После завершения, место unprobed microarray слайды в светозащитной коробке в desiccator шкаф при комнатной температуре. Чтобы исследовать серу для антител на microarray, используйте клипы, чтобы прикрепить microarray слайды площадку сторону вверх на зондирующие камеры и поместить камеры в кадрах.
Будьте осторожны при сборке слайдов, так как они легко ломаются и проверяют на наличие утечек после регидратации. При необходимости разобрать и собрать слайды, чтобы исправить утечки. Увлажнить слайды 100 микролитров фильтрованного блокирующего буфера на колодец и разбавить серу в соотношении 1 к 100 в 100 микролитров блокирующего буфера на образец.
Затем инкубировать регидратированные микросхемы и разбавленную сыворотку в течение 30 минут при комнатной температуре и от 100 до 250 вращений в минуту на орбитальном шейкере. В конце инкубации используйте наконечники пипеток, подключенные к вакуумной линии со вторичной колбой для сбора, чтобы тщательно аспирировать блокирующий буфер из угла каждой камеры, не касаясь колодок, и немедленно добавить разбавленную сыворотку в прокладки, не позволяя прокладкам высохнуть. Затем поместите покрытые рамы в лотки, содержащие влажные бумажные полотенца запечатаны для поддержания влажности и инкубировать кадры на ночь при четырех градусах по Цельсию на качалке.
Для квантовой точки конъюгированных вторичных антител маркировки, тщательно аспирировать сыворотки, как только что продемонстрировали и промыть слайды с тремя моет в 100 микролитров свежего буфера TTBS на колодец в течение пяти минут каждый на орбитальной шейкер. Слайды затем инкубируется смесью квантовой точки, спрягают вторичные антитела, а затем промывают три раза, как описано в протоколе, используя ту же технику, что и только что продемонстрировано. После последней стирки аккуратно удалите горки из камер и аккуратно промойте горки фильтрованной двойной дистиллированной водой, а затем поместите каждую горку в 50-миллилитровую трубку.
Затем высушите горки центрифугой. Чтобы получить изображения слайдов microarray, сначала включите портативный образец и аккуратно поместите слайд, который будет изображен лицом вниз, в держатель слайда в камере визуализации. Откройте программное обеспечение для визуализации и под вкладкой configure Imager выберите соответствующую конфигурацию слайдов.
Под вкладкой управления изображением выберите соответствующий флуоресцентный канал и отрегулируйте время экспозиции и приобретения в зависимости от реактивности сыворотки. Затем нажмите захват, чтобы начать получение изображения. В конце приобретения используйте сетки, ориентированные на фидуциальные маркеры, для обнаружения пятен массива.
Чтобы измерить интенсивность пятна, в панели файловой информации загрузите файл gal и укажите папку, где выводные файлы анализа должны быть сохранены в разделе вариантов анализа. Под вкладкой управления изображением откройте одно из приобретенных изображений для количественной оценки и выберите автоматическое. В разделе анализа массивов создайте фидуциальный шаблон в соответствии с инструкциями программного обеспечения.
Нажмите пакетный анализ, чтобы выбрать папку, которая содержит изображения, которые будут количественно и выбрать fiducial шаблон, который только что был создан. Программное обеспечение будет анализировать каждое изображение и количественно интенсивности пятна. Затем проанализируйте необработанные данные, чтобы сравнить связывание антител между антигенами и образцами сыворотки.
В этом репрезентативном исследовании, вторичные антитела, используемые были Коза анти-человеческой IgG спряженных квантовой точкой, излучающей на 800 нанометров и Коза анти-человеческого IgA спряженных квантовой точкой, излучающей на 585 нанометров для мультиплексного обнаружения igG и IgA антител соответственно. В результирующей тепловой карте были помечены только клинически значимые подтипы с высоким представлением, чтобы сэкономить место со знаком плюс, обозначающим все остальные подтипы большего числа. Сыворотка IgA и IgG были сгруппированы по их гемагглютинин и нейраминидазы молекулярных форм и подтипов.
Продемонстрировать высокую специфичность антител головной группы гемагглютинина для клинических подтипов и высокую перекрестную реактивность цельного гемагглютинина и триамеризированных целых антител гемагглютинина с включением региона запасов. Реакция антител гриппа, измеренная на микроаррее, может быть подтверждена традиционными методами, включая ингибирование гемагглютинации и анализ микронейтрализации. Этот метод дает представление о специфике подтипа антител к группе голов гриппа и относительной важности антител IgA и IgG к восприимчивости к гриппу.
Хотя ни одно из материалов не является чрезвычайно опасным, все образцы сыворотки человека должны обрабатываться в соответствии с институциональными протоколами биобезопасности.
