Это метамфетаминика большое количество 3D гепатосфер человека плюрипотентных стволовых клеток с использованием тонких материалов и клеток сборки. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет контролировать размер 3D сфер печени, ограничивая образование некротических центров и потерю фенотипа. Демонстрацией процедуры со мной будет Yu Wang, пост-докторская степень в нашей лаборатории.
Приготовьтесь представить агарозные формы, растворив два грамма низкоплавильной температурной агарозы в 100 миллилитров стерилизованной дистиллированной воды. Тщательно нагреть смесь в микроволновой печи с интервалом встряхивания, чтобы полностью растворить агарозу. Добавьте 520 микролитров расплавленной агарозы в 256 хорошоформатных форм и дайте ей затвердеть.
Затем перенесите каждую микро пластину агарозы в один колодец из 12-хорошо пластины. Добавьте 1,5 миллилитров DPBS с кальцием и магнием к каждой хорошо и пипетки вверх и вниз, чтобы удалить пузырьки. Чтобы подготовить клеточной суспензии, начните с аспирации среды от недифференцированной культуры человеческих плюрипотентных стволовых клеток, или HPSCs.
Промыть клетки, добавив пять миллилитров комнатной температуры DPBS, кальция или магния бесплатно, а затем удалить буфер. Добавьте пять миллилитров реагента диссоциации клеток в клетки и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение шести-восьми минут. Наблюдайте за отслогонием клеток под микроскопом и при необходимости продлите инкубацию еще на одну-две минуты.
Остановите реакцию, удалив реагент диссоциации клеток и добавив пять миллилитров свежего МТ, подавайте одну среду, дополненную 10 ингибитором микромолярной породы, Y27632. Pipette вверх и вниз несколько раз, чтобы разобщить клетки. Подсчитайте жизнеспособные клетки с гемоцитометром и трипаном синего окрашивания, чтобы вычислить общее количество необходимых клеток.
Перенесите нужное количество клеток в стерильную 15 или 50 миллилитровую центрифугу и центрифугу при 200 раз G в течение пяти минут, чтобы гранулировать клетки. Отбросьте супернатант и повторно приостановьте клетки в МТ, подавайте одну среду с 10 микромолейными ингибиторами породы для окончательной концентрации 2,1 миллиона клеток на миллилитр. Далее, сохранить клетки, добавив 190 микролитров подготовленной клеточной подвески на агарозу микро хорошо и инкубации агарозы микро пластин при 37 градусов по Цельсию в пять процентов углекислого газа в течение двух часов.
После инкубации, добавить один миллилитр свежих, теплых, T-служить одной среде с ингибитором рок к каждому хорошо. Верните тарелки в инкубатор и оставьте их там на 24 часа. На следующий день изучите сферу формирования.
Подготовка поли-два гидроксиетилметила метакрилата или поли-гемы покрытием скважин путем растворения двух граммов поли-гемы в 100 миллилитров 95% этанола и перемешивания раствора на ночь на 55 градусов по Цельсию горячей пластины. На следующий день добавьте 250 микролитров раствора к каждому колодец 24-хорошо пластины и высушите пластину на ночь в духовке 60 градусов по Цельсию. Инициировать дифференциацию гепатоцитов путем тщательного удаления МТ служить одной среде из ранее посеянных клеток и заменить его на один миллилитр свежей эндодерм дифференциации среды.
Для эмбриональных стволовых клеток человека, освежить средний каждые 24 часа в течение трех дней. Важно инициировать дифференциацию гепатоцитов 24 часа после посева, чтобы избежать спонтанной дифференциации клеток. После окончательной индукции эндодерма, переключить средний на гепатобласт дифференциации среды в течение пяти дней.
Замените носитель каждые два дня, выполняя последнее изменение в последний день спецификации гепатобласта. Для переноса гепатосфер в подготовленные поли-гемы покрытые скважины, мыть клетки с гепатоцитов созревания среды, а затем добавить один миллилитр среды дополняется 10 нанограмм на миллилитр HGF и 20 нанограмм на миллилитр OSM. Pipette раствор вверх и вниз несколько раз, чтобы поднять гепатосферы из агарозы микро пластины и передать их в поли-гема покрытием хорошо.
Вымойте микро пластину агарозы одним миллилитром дополнительной среды созревания гепатоцитов и перенесите среду в полигему, покрытую хорошо. Используя пипетку P-100, тщательно аспирировать избыток среды без удаления гепатосфер до тех пор, пока в колодец не остается около одного миллилитра среды. Освежите носитель каждые 48 часов в течение 12 дней.
При работе с эмбриональными стволовыми клетками, переключить средний гепатоцитов поддержания среды на 20-й день, удалив созревания среды, мыть клетки с обслуживанием среды, а затем добавить один миллилитр дополнительного среднего обслуживания. После этого обновлять носитель каждые 48 часов. Немедленные изменения должны быть выполнены тщательно, чтобы избежать серьезного стресса и искажения этой сферической структуры.
Окрашивание гепатоцитов в мезенхимальных маркерах упивается тем, что гепатосферы, сформированные с помощью этой техники, состоят из гепатоцитов, как клетки, окружающие ядро мезенхимальных клеток. Другие белки, обычно выраженные в гепатоцитах, также находятся на внешнем слое сфер. Функциональный анализ ферментов цитохрома P450 или CYP в 30-дневных гепатосферных культурах показал, что 3D-сферы демонстрируют респектабельный уровень активности CYP по сравнению с первичными гепатоцитами человека.
Кроме того, можно продемонстрировать, что гепатосферы выделяет белки печени, такие как альбумин и альфа-фетопротеин. Самое главное, что нужно помнить для этого протокола, чтобы мягко pipette вверх и вниз решение, содержащее 3D гепатосферы при передаче их в поли-гема покрытием пластины. Это помогает избежать повреждения их.
После освоения, эта методология позволяет генерации 3D сфер печени, которые остаются функциональными в течение года в пробирке с несколькими приложениями в моделировании болезни и скрининга наркотиков. Заглядывая в будущее, эта технология может быть использована в качестве платформы для дальнейшей энтодермальной и мезенхимальной ткани со сложными архитектурами.
