Протокол восстановления и синтеза, описанный здесь, является эффективным способом изучения мембранных белков в модели липидного бислойного и липидного смешивания белками синтеза. Здесь мы описываем моющее средство с помощью восстановления рекомбинантных drosophila атластин, ER синтез белка, в предварительно фосфатидилхолин липосомы. Слияние атластин протеолипосом затем измеряется FRET основе липидно-смешивания анализа.
Одним из ключевых преимуществ восстановления с помощью моющего средства является то, что белок в моющих средствах не подвергается высыханию или растворителям. Мы также показываем здесь, что реконституционная ориентация атластина очень эффективна. Еще одним преимуществом анализа липидного смешивания на основе FRET является то, что липосомы не должны быть загружены с любым красителем, и нет необходимости в каких-либо дополнительных шагов диализа.
Для начала этой процедуры подготовьте запасы липидной смеси в хлороформе, как указано в текстовом протоколе. Добавьте одну микрокурию на миллилитр DPPC в липидные смеси, убедившись, что зарезервировать по крайней мере восемь микролитров этого запаса. Перенесите нужное количество липидных смесей в кремневые стеклянные трубки.
Затем высушите липидные смеси под нежным потоком азотного газа в течение примерно 10 минут, пока не будет видно больше хлороформа. Высушите полученную липидную пленку дальше в децикаторе, пылесосив в течение 30 минут. После этого добавьте достаточноЕ количество A100 с 10%глицеролом, двухмилимолейным 2-меркаптоэтаноном и одномимимолярной ЭДТА в липидную пленку, чтобы вернуть концентрацию до 10 миллимолей.
Resuspend липидной пленки, вихри слегка в течение 15 минут при комнатной температуре. Заморозить гидратированные липиды в жидком азоте. Чтобы разморозить липосомы, пусть раствор сидит при комнатной температуре в течение 30 секунд, а затем передать их обратно в воду для более быстрого оттаивания.
Повторите этот цикл замораживания-оттепели в общей сложности 10 раз. После этого используйте мини-экструдер для прохода липидов через поликарбонатные фильтры, с пор размером 100 нанометров, 19 раз. Для определения общей концентрации липосом липидов добавьте четыре микролитера липидного бульона и лизосомы в три миллилитра сцинтилляционного коктейля.
Измерьте среднее количество в минуту для запасов и липосом, и вычислите липосомную концентрацию, как указано в текстовом протоколе. Храните липосомы при четырех градусах по Цельсию в течение одной недели. Во-первых, смешать соответствующее количество буфера, дополнительного моющего средства и белка в 0,5-миллилитровую трубку, как указано в текстовом протоколе.
Быстро добавляйте липосомы и сразу вихрем в течение пяти секунд гомогенизируйте смесь. Инкубировать реакцию в nutator при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа. Во время этой инкубации, вес 0,2 грамма полистирола адсорбент бисера и передать их в трубку микроцентрифуг.
Добавить один миллилитр метанола в трубку, и смешать в течение одной минуты, чтобы дегазать бисер. Затем, аспирировать метанол с 21-го калибра или выше иглы. Чтобы начать мыть бисер, добавьте к ним воду.
Пусть бисер смешать с водой в течение пяти минут, а затем аспирировать воду. Повторите этот процесс мытья воды четыре раза. После этого добавьте воду, чтобы принести полистирол адсорбент суспензии до объема одного миллилитра, с окончательной концентрацией 0,2 грамма на миллилитр.
Рассчитайте количество полистирола адсорбента, необходимого для адсорбировать все моющее средство в каждом образце, как указано в текстовом протоколе. Вырезать наконечник пипетки для сбора шарика суспензии. Перенесите вычисленное количество суспензии шарика в трубку объемом 0,5 миллилитров и оспирировать воду.
Добавить образцы в трубку, содержащую бисер, и инкубировать в nutator при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа. Перенесите образцы в свежую трубку, содержащую новые бусы, убедившись, что оставить старые бусы позади. Инкубировать снова, используя те же условия.
Повторите этот процесс переноса и инкубации бисера два раза. После этого перенесите образец в новую трубку, содержащую свежие бусы, и инкубировать, окутав на ночь при четырех градусах по Цельсию. На следующий день удалите образец из бисера и центрифуги при 16 000 г и 4 градусах по Цельсию в течение 10 минут, чтобы гранулировать нерастворимые белковые агрегаты.
Восстановите супернатант и определите окончательную концентрацию липидов путем подсчета жидких сцинтилляций, как указано в текстовом протоколе. Для начала довнесите донора и приемщика протеолифосом до концентрации 0,15 миллимоляра в A100, содержащей глицерол, бета-меркаптоэтанол, ЭДТА и хлорид магния. Передача каждой реакции на колодец в плоской пластине 96-колодец подходит для чтения флуоресценции, убедившись, что подготовить по крайней мере четыре реакции, в том числе тройной и не-GTP отрицательный контроль.
Поместите тарелку в разогретую плиту при 37 градусах по Цельсию. Измерьте флуоресценцию NBD каждую минуту в течение пяти минут. Затем добавьте пятимимолярный GTP, чтобы вызвать слияние.
Измерьте флуоресценцию NBD каждую минуту в течение одного часа, используя то же возбуждение и выбросы, что и раньше. После этого добавьте пять микролитров 2.5%n-Dodecyl бета-D-мальтозида к скважинам, чтобы растворить протеолипосомы, и измеряйте максимальную флуоресценцию NBD каждую минуту в течение 15 минут, используя то же возбуждение и выбросы. В этом исследовании рекомбинантный атлас Drosophila очищается и воссоздается в предварительно сформированные липосомы.
Эффективность восстановления атластина определяется плавающими восстановленными протеолипосомами в iohexol разрывном градиенте. Образцы верхних, средних и нижних градиентных слоев собирают и анализируются Окрашиваниями SDS-PAGE и Coomassie. Количественная оценка геля по денситометрии показывает очень высокую эффективность восстановления с незначительными теряет, с 96% от общего белка, найденных в качестве протеолипосомы, которые плавали в верхний слой.
Менее 1% белка неконституционируется и содержится в среднем слое, и только 3% неконституционированных или агрегированных и отложений в нижний слой. Ориентация атластина после восстановления измеряется анализами тромбина. Образцы анализируются с SDS-PAGE и Coomassie окрашивания и количественно денситометрии.
Большая часть восстановленного белка расщепляется, и только 7% защищены от протеазы. Кинетики и степень атластин-опосредованного синтеза протеолипосомы анализируются с помощью липидных анализов. Инкубация в пять минут выполняется перед индуцированием синтеза с GTP в точке нулевого времени.
Через час, n-Dodecyl бета-D-мальтозид был добавлен для solubilize протеолипосомы и получить максимальный флуоресцентный резонанс передачи релиз. Максимум синтеза в пробеге считается 11% от максимальной флуоресценции. Липиды растворяются в хлороформе.
При подготовке липидных смесей, убедитесь, что сделать это быстро, на химическом капюшоне, и на льду, чтобы избежать испарения. Можно проанализировать атластин протеолифосомы с помощью микроскопии, чтобы визуализировать влияние мембранного якоря на липосомную форму и размер. Этот метод был расширен для изучения других мембранных якорных белков и как ведут себя в модели липидного билейера.
Этот протокол использует титрованная липиды для количественной оценки липидных смесей. Убедитесь в том, чтобы принять необходимые меры предосторожности при работе с радиоактивными материалами.
