Трансплантация тимуса является важным методом для изучения функции эпителиальных клеток тимуса и Т-клеток созревания in vivo. Этот простой и эффективный протокол может быть использован для изоляции и культуры мыши 18,5 тимуса для последующей трансплантации в почечную капсулу. Протокол для трансплантации тимуса 18,5 может быть изменен для тимической трансплантации на других стадиях развития или для других тканей аналогичного размера.
Кроме того, эта процедура очень проста. Детали некоторых марок корпуса должны быть тщательно рассмотрены при выполнении этого метода в первый раз. Эта процедура содержит подробные манипуляции, которые можно лучше проиллюстрировать с помощью визуализации.
После жертвоприношения протрите эмбриональный день 18,5 беременной мышью с 70% этанола и используйте автоматически стерилизованные инструменты, чтобы сделать V-образный разрез на животе от мочевого пузыря до каждого рога матки. Используйте ножницы, чтобы сократить мезотрий и шейки матки и вагинальных областях и урожай матки в чашку Петри, содержащий холодный PBS на льду. Вырезать переднюю стенку матки от одного рога матки к другому, чтобы подвергать эмбрионы в оболочке, чтобы decidua и использовать тонкие пинцеты, чтобы очистить назад решающих тканей.
Разрежьте пуповину, чтобы выпустить эмбрионы для переноса в новую чашку Петри на льду. Чтобы собрать первый тимус, протрите один эмбрион 70%-ти алкоголем и перенесите эмбрион в новую чашку Петри. После обезглавливания закрените эмбрион в блюде в положении на спине и используйте стерильные ножницы, чтобы разрезать боковой грудной стенки горизонтально вдоль подмысного фронта.
Вырезать диафрагму, чтобы открыть грудь. Тимус должен быть виден как две белые доли, расположенные перед трахеей и прилегающие к сердцу. Аккуратно вставьте изогнутые миппы кончика за тимусом и аккуратно подтяните, чтобы собрать ткань.
Проверьте целостность тимуса, чтобы подтвердить, что он содержит две совместные доли. Затем мыть тимус с PBS перед использованием стерео микроскопа, чтобы обрезать соединительной ткани и кровеносные сосуды. Когда все тими были собраны, передать каждую чистую ткань в отдельных скважин 24 хорошо пластины, содержащей 500 микролитров культуры среды на колодец.
И добавить 2'deoxygranosine к окончательной концентрации 1,25 миллимолара на колодец. Затем поместите изолированные тими в инкубатор клеточной культуры в течение восьми дней. В последний день культуры, использовать ножницы, чтобы сократить скальп вены иглы на инфузии трубки часть под углом 45 градусов и подтвердить отсутствие ответа на ноги щепотку в обнаженном животном получателя.
Поместите мышь на операционный стол в правом боковом положении и используйте 0,5%povidone йод мазок мазок кожи в хирургической области два раза изнутри на улицу тела. Используйте скальпель, чтобы сделать пять-девять миллиметров кожи разрез параллельно позвоночника в левой области почек и прорезать подкожной ткани и мышцы, чтобы открыть брюшную полость. Используя пару пинцетов одной рукой, поднимите мышцы и жировую ткань из края разреза позвоночника открытой почки и используйте другую руку, чтобы аккуратно выжать почку.
Чтобы сохранить почечную капсулу влажной во время операции, мокрой поверхности почки с солевым раствором и использовать скальп иглы мягко поцарапать почечную капсулу на нижней правой стороне около 1/2 до 2/3 ширина почки. Сдвиньте инфузионные трубки в ник капсулы и осторожно отделить почечную капсулу от почки долго длинной стороне почки около трех-четырех миллиметров в капсулу почки. Затем втягивать инфузионные трубки.
Чтобы имплантировать тимус в созданное подкапсулярное пространство, дважды промыть тимус одной культуры свежим солевым раствором и подключить обрезанную инфузионные трубки к шприцу. Медленно аспирировать подготовленный тимус в модифицированную инфузионные трубки. И аккуратно вставьте инфузионные трубки в почечную капсулу, пока она не достигнет высшего полюса.
Чтобы доставить тимус в почечную капсулу, медленно убирайте трубку, одновременно мягко угнетая поршень. Используя спиртовую лампу, слегка нагревайте иглу кожи головы и, подтвердив, что весь тимус находится внутри подкапсулярного пространства, используйте нагретую иглу, чтобы прижигать ник. Восстановить прижигаемую почку в брюшной полости и закрыть брюшной полости и мышцы с швами.
Используя модифицированный прерванный вертикальный шов матраса, закройте разрез кожи по крайней мере тремя узлами и используйте мазок йода povidone для дезинфекции разреза. Затем обеспечить подкожные инъекции антибиотиков и анальгезии и поместить мышь под инфракрасную лампу с мониторингом до полного выздоровления. Здесь можно наблюдать изолирующий эмбриональный день 18,5 тимуса, содержащий две полные доли.
Сразу после имплантации тимус можно визуализировать под почечной капсулой на кончике почки реципиента. После восьми недель роста в обнаженной мыши получателя животных, тимус остается под капсулой, но значительно увеличивается в размерах. Т-клетки производятся как в пересаженном тимусе, так и в периферической крови получателей обнаженных мышей.
Но, как и ожидалось, никаких Т-клеток не обнаруживается в периферических не пересаженных обнаженных животных. Кроме того, в этом репрезентативном эксперименте в периферических Т-клетках, собранных из периферической крови реципиентов обнаженной мыши, пересаженных с помощью тигмусовых долей, содержащих аллель Лака, не было обнаружено ни одного гена лака, что указывает на то, что периферические Т-клетки были получены от животных-реципиентов. Будьте нежны при скольжении трубки в почечную капсулу.
Избегайте взлома капсулы. И убедитесь, что у вас есть достаточно места в для доставки тимуса. Тимические или периферические Т-клеточные популяции могут быть проанализированы с помощью цитометра потока.
Где иммунные реакции в периферических тканях реципиента могут быть проанализированы I2d и иммунным гистохимическим анализом.
