Этот протокол предоставляет платформу для изучения ответов клеток CD4T, которые часто слабы и трудно обнаружить. Этот метод позволяет обнаруживать, перечислять и изоляцию клеток CD4T без предварительного знания относительно представления антигена. Основным преимуществом является анализ клеток CD4T, которые довольно часто редкие популяции, связанные с аутоиммунными заболеваниями, такими как диабет типа один.
После получения периферического образца крови от здорового донора, разбавить кровь в PBS, по крайней мере один к двум соотношению до наслоения 35 миллилитров крови более 15 миллилитров плотности градиента среды в 50 миллилитров трубки. Раздели клетки по плотности градиентной центрифугации и удалите около 20 миллилитров полученного верхнего плазменного слоя. Затем соберите белый слой клеток крови, заботясь, чтобы избежать гранул красных кровяных телец и мыть клетки три раза в свежем PBS.
После подсчета, разбавить клетки в один раз от 10 до шестой периферической крови моноядерной клетки или PBMC на миллилитр концентрации PBS. Добавьте 300 микролитров клеток для каждого контроля в отдельные 10 миллилитровых трубок. После долива каждой трубки с PBS, осадок клеток центрифугации и повторного перерасхода клеток в один раз от 10 до шестой клетки на миллилитр rp5 средней концентрации.
Затем пластины 100 микролитров клеток на контроль в каждой из трех скважин 96 пластины, содержащей 100 микролитров RP5 среды на скважину. Поместите тарелку в инкубатор клеточной культуры на семь дней. Затем перенесите оставшиеся ПБМТ в новую 50-миллилитровую трубку и добавьте один микролитр рабочего раствора CFSE на один миллилитр клеточной подвески в сторону трубки.
Быстро инвертировать трубку несколько раз, чтобы смешать и поместить клетки в инкубатор культуры клеток в течение пяти минут. В конце инкубации, арестовать реакцию с пятью миллилитров RP5 среды и собирать клетки центрифугации. Resuspend гранулы в один раз от 10 до шестого PBMCs на миллилитр свежей среды RP5 и добавить один миллилитр клеток к одной 10 миллилитровой трубки на антиген для тестирования.
Затем добавьте 100 микролитров клеток на антиген к каждой из трех скважин из 96 скважин, хорошо содержащих 100 микролитров среды RP5, дополненных разбавленным антигеном интереса на скважину. Поместите тарелку в инкубатор клеточной культуры на семь дней. Чтобы испачкать популяции клеток CD4'T для цитометрического анализа потока, в конце культуры переносить весь объем клеток из каждого хорошо в отдельные флуоресценции активированной сортировки клеток или FACS труб.
Вымойте каждый образец одним миллилитром PBS, дополненным сывороткой 0,1%fetal calf или FCS. Повторное использование гранул в соответствующих анти-человеческих антител CD4 в 100 микролитров PBS плюс FCS на трубку. Инкубировать клетки при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут защищены от света.
В конце инкубации, мыть образцы в один миллилитр свежего PBS плюс FCS на трубку и повторно гранулы в 100 микролитров свежих PBS плюс FCS. Непосредственно перед анализом добавьте один микролитер йодида пропидия в каждую трубку, чтобы исключить мертвые клетки. Ворота лимфоцитов в соответствии с их вперед и стороны рассеяния областях.
Чтобы исключить апоптотические клетки, ворота вперед рассеяния области по сравнению с пропидия йодида отрицательных клеток и использовать неописуемые клетки, чтобы установить базовый уровень напряжения для нефлуоресцентных клеток. Установите напряжение для флюорофора антител CD4 и сигнала CFSE так, чтобы флуоресцентный сигнал был ниже 1000 для каждого. Используйте единый цветовой контроль CFSE и CD4 образцов для подтверждения положительного флуоресцентного сигнала для каждого цвета с помощью напряжения, установленного с неоплеканными клетками.
Поскольку CFSE и йодид пропидия имеют некоторые спектральные перекрытия, отрегулируйте компенсацию, чтобы вычесть флуоресценцию пропидия йодида из флуоресценции CFSE до тех пор, пока только образец CFSE не даст сигнала в канале пропидия йодида. Когда все образцы были проанализированы, вычислить индекс деления клеток, разделив количество разделенных клеток на 5000 неразделеных клеток из антигена стимулировали группу среднее количество разделенных клеток на 5000 неразделеных клеток из клеток, культурных без антигена. Почти все доноры демонстрируют сильную Т-клеточную реакцию на столбняк токсоид после стимуляции in vitro, потому что доноры были вакцинированы, что делает столбняк токсоид полезным положительным антигеном контроля.
Однако распространение клеток CD4-T из нестимулированных ПМГ является минимальным. После семи дней стимуляции с человека про-инсулин C-пептид, про-инсулин C-пептид конкретных клеток CD4'T могут быть обнаружены в периферической крови человека с диабетом типа 1. PBMC стимулируется с гриппом вирус матричного белка также демонстрируют пролиферацию.
Взятые вместе, эти данные показывают, что анализ может быть выполнен с использованием белков полной длины, а также короткие синтетические пептиды. Компонент FACS этого метода может быть выполнен с помощью цитометра потока сортировки клеток. Используя сортер клеток, антиген-специфические Т-клетки могут быть изолированы на уровне одной клетки для анализа ниже по течению.
Этот метод позволил для открытия CD4T клеточных реакций у людей с ранним началом диабета типа один. Анализ этих редких Т-клеток населения с использованием других методов представляет различные технические проблемы.
