Общей целью этой экспериментальной процедуры является генерация инфекционного рекомбинантного вируса Зика из полномедательного клона кДНА, собранного в бактериальной искусственной хромосоме под контролем цитомегаловируса человека. Разработка обратной генетической системы рнк-вирусов, таких как вирус Зика, позволяет непосредственно манипулировать геномом вируса для изучения нескольких аспектов вирусной биологии и патогенеза и разработки стратегии вакцинации. Основным преимуществом этого метода является то, что строительство инфекционного клона вируса Зика как бактериальной искусственной хромосомы преодолевает токсичность, связанную с геномом флавивируса, и позволяет спасти инфекционный вирус путем прямой трансфекции клона BAC cDNA в восприимчивые клетки.
Эта методология может быть применена для построения стабильных и полностью функциональных инфекционных клонов кДНК для других флавивирусов, а также других положительно-застрявших РНК-вирусов. Чтобы начать эту процедуру, создайте клон вируса Зика cDNA, как указано в текстовом протоколе, используя соответствующие сайты ограничения. Четыре фрагмента ДНК, охватывающих геном вируса Зика в окружении человека CMV промоутер на пяти-премьер конце и вирус дельты гепатита рибосомы и бычьего гормона роста прекращения и полиаденилирования последовательности на трех-премьер конце собраны в бактериальной искусственной хромосомы плазмиды.
Во-первых, вырастить одну колонию E.coli DH10B проведения pBAC-Зика вирус инфекционного клона в пять миллилитров LB среды, содержащей хлорамфеникол в течение восьми часов при 37 градусов по Цельсию с нежной тряски. Затем добавьте 500 миллилитров среды LB, содержащей хлорамфеникол, в двухлитровую колбу. Добавить один миллилитр подготовленной бактериальной культуры в колбу и расти клетки при 37 градусов по Цельсию в течение 14 до 16 часов, пока OD600 составляет примерно 0,6 до 0,8.
После этого используйте коммерческий комплект, специально разработанный для очистки BAC, чтобы очистить клон BAC infection cDNA щелочным лизом, следуя инструкциям производителя. За день до трансфекции, пластины Vero клеток в скважины из шести скважин пластины при плотности 500000 клеток на скважину в среде роста. Чтобы подготовить смесь трансфекции, добавьте четыре микрограмма клона BAC cDNA до 250 микролитров сыворотки, уменьшенной средой, и тщательно перемешайте.
В отдельной трубке разбавляют 12 микролитров трансфектного агента в 250 микролитров сыворотки уменьшенной среды. Вихрь смешивать и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем объединить разбавленный BAC cDNA с трансфектным агентом.
Тщательно перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 20-30 минут. В течение этого инкубационный период, использовать средний рост без антибиотиков, чтобы мыть клетки Веро и оставить клетки в один миллилитр свежей среды без антибиотиков. Затем распределите 500 микролитров смеси кДНА и трансфекции реагентов на клетки Веро.
Рок пластины туда и обратно, чтобы смешать и инкубировать клетки во влажном инкубаторе при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа в течение шести часов. После этого удалите трансфекцию среды и добавьте два миллилитров свежей среды роста с антибиотиками. Инкубировать клетки во влажном инкубаторе при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом, убедившись, чтобы проверить каждый день для индукции цитопатический эффект.
После четырех-шести дней трансфекции, когда CPE составляет около 50 до 75% собирать супернатанты культуры тканей в 15-миллилитровых конических труб и центрифуг в течение 10 минут, чтобы удалить клеточный мусор. Затем собрать супернатанты, содержащие рекомбинантный вирус Зика и отказаться от клеточных гранул. Aliquot супернатант в криотрубах и хранить их при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Для начала вырастите клетки Веро до 90% слияния. Вымойте клетки два раза с PBS и заразить их спасенным вирусом с множественностью инфекции 0,1 в среде роста, содержащей 2%FBS. Поместите пластины клеток во влажный инкубатор при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом и рок каждые 15 минут в течение 90-минутного периода adorption.
После вирусной адсорбции, удалить вирусный инокулум и добавить свежий рост среды с 2%FBS. Инкубировать три или четыре дня на тех же условиях, используемых ранее. Когда CPE составляет около 75%собирать ткани культуры supernatant и центрифуги для удаления клеточного мусора.
Затем собрать супернатант, содержащий рекомбинантный вирус Зика, и выбросить гранулы. Aliquot супернатант в криотрубы. Поместите трубки в коробку для замораживания и храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Когда вы будете готовы, удалите вирус aliquot из морозильной камеры и определить вирусный titer по налету анализ, как указано в текстовом протоколе. В этом исследовании, стабильный, полнометражный клон кДНК штамма вируса Зика Rio Grande do Norte Natal генерируется путем последовательного клонирования четырех перекрывающихся фрагментов кДНК в бактериальную искусственную хромосому pBeloBAC11 с использованием обычных методов клонирования и уникальных сайтов ограничения, присутствующих в вирусном геноме. Этот полнометражный клон cDNA был в окружении на пять премьер конце человека цитомегаловирус промоутер, чтобы выражение вирусной РНК в ядре трансфицированных клеток и на три премьер-конец рибосомы вируса дельты гепатита следуют прекращения гормона роста крупного рогатого скота и полиаденилирования последовательности для производства РНК, содержащих точные три премьер конца вирусного генома.
После того, как cDNA BAC собран, инфекционный вирус может быть легко восстановлен после прямой трансфекции восприимчивых клеток Веро с клоном BAC cDNA с помощью катионных липосом. Используя этот подход, R вирус Зика RGN можно спасти с титлерами выше, чем один миллион бляшек формирования единиц на миллилитр. Кроме того, спасенный вирус вызывает явный цитопатический эффект и генерирует однородные бляшки размером около двух миллиметров.
Спасенная идентичность вируса подтверждается с помощью иммунофлуоресценции анализа с использованием специфических моноклональных антител для белка вируса Зика Е. В целом, эти результаты показывают, что инфекционный рекомбинантный вирус Зика может быть спасен от полнометражных клонов кДНА, собранных в BAC. Таким образом, мы разработали мощный вирус Зика обратного генетического подхода, основанного на использовании бактериальной искусственной хромосомы, которые могут быть адаптированы для создания стабильных и функциональных инфекций с клоном кДНК других положительно-стрестовых РНК вирусов для облегчения изучения патологии, разработки вакцины, а также для облегчения идентификации препарата с противовирусной активностью.
