В этом протоколе мы подробно в пробирке модель человеческой тауопатии. Этот метод заполняет потребность в материалах, которые могут быть полезны для скрининга лекарств и исследований механизма заболевания. Основным преимуществом этой техники является то, что парадигма клеточной культуры позволяет более быстро оценить токсичность тау и потенциальную тау-терапевтику по сравнению с исследованиями на животных, чтобы начать эту процедуру оттепели оболочки мембраны покрытия для культуры пластин на четыре градуса по Цельсию.
Сделайте одноми миллилитровые алициты и храните их при температуре минус 20 или минус 70 градусов по Цельсию. Далее, восстановить основной фактор роста фибробластов в стерильных PBS при концентрации 10 микрограмм на миллилитр. Сделайте 10-микролитровые алициты и храните их при четырех градусах цельсия.
Затем отправился новый неоткрытый 500-миллилитровый бутылку DMEM-F12 с глутамином. Добавьте 10 миллилитров B27, пять миллилитров N2 и пять миллилитров пенициллина-стрептомицина для подготовки нервных стволовых клеток. Поместите 50 миллилитров НСК-медиа в коническую трубку и добавьте 10 микролитров подготовленного bFGF.
Храните этот NSC плюс bFGF СМИ при четырех градусах по Цельсию. Во-первых, удалить aliquot замороженных мембранных мембранных покрытий для пластин клеточной культуры из морозильной камеры, и это позволяет оттаивать при четырех градусах по Цельсию. Добавьте 385 микролитров оттаялого мембранного мембранного матричного покрытия к пяти миллилитров средств массовой информации DMEM-F12, содержащих пенициллин-стрептомицин.
Если клетки оттаивают от замороженных запасов НСК, возьмите флакон замороженных клеток из морозильной камеры и согреть его в водяной бане, нагретой до 37 градусов по Цельсию, перемещая флакон туда и обратно в воду. После этого распылите флакон 70%этанолом. Затем под капотом клеточной культуры, передать клетки примерно 10 миллилитров DMEM-F12 средств, содержащих пенициллин-стрептомицин.
Центрифуга при комнатной температуре 1000 раз г в течение пяти минут. Затем аспирировать средства массовой информации и повторного перерасхода ячеек в НСК СМИ. Разбавить клетки в средствах массовой информации НСК, чтобы получить соответствующую плотность посева для сосуда клеточной культуры, который используется.
Добавить достаточно клеток приостановлено в средствах массовой информации НСК, чтобы семена мембраны подвала матрицы покрытием культуры блюд. Выращиваем клетки при 37 градусах Цельсия с 5%-ным углекислым газом до тех пор, пока они не будут на 75-80% совлиять, убедившись, что они меняют средства массовой информации через день. Чтобы вывести нейроны с лентивирусом, используйте titer кол 340000 предуваемых единиц на клетку.
Разбавить превью единиц в клеточной культуре средств массовой информации в необходимой концентрации, и добавить их в клетки. Через два дня после добавления лентивируса, мыть клетки один раз со свежими средствами массовой информации, которые не содержат bFGF. Продолжить культивирование клеток при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в средствах массовой информации без bFGF.
Поддерживайте клетки в течение примерно восьми недель после трансдукции, убедившись, что изменить медиа культуры клеток через день. Используйте световой микроскоп, чтобы регулярно визуализировать клетки и обеспечить жизнеспособность. После трансдукции, удалить культуру блюда из инкубатора убедившись, что держать крышку на них, чтобы сохранить культуру хорошо стерильной.
Используйте флуоресцентный микроскоп, способный живую визуализацию клеток, чтобы визуализировать клетки под 10X цели с возбуждением 514 нанометров и эмиссионного фильтра 527 нанометров. В этом исследовании нейроны, вызванные tau-RDLM-YFP лентивирус флуоресцентно помечены YFP. Культуры, вызванные RDLM, отображают агрегаты после трансдукции.
Эти включения пятно положительное для thioflavin. Нейронная дифференциация подтверждается иммунолабелированием нейронного маркера бета-тубулина III в культурах. Важно помнить, что флуоресцентно помеченные вторичные антитела должны иметь возбуждающий спектр выбросов, который не пересекается с спектром YFP.
Хотя желтые агрегаты флуоресценции тау будут видны при отсутствии окрашивания, тиофлавин также следует использовать для визуализации, чтобы подтвердить, что флуоресцентный сигнал агрегируется тау, а не клеточный мусор. После генерации тау overexpressing клеток, ряд оценок здоровья нейронов и тау агрегации могут быть выполнены. Например, мы обнаружили, что эти клетки отображают аксональной дегенерации.
В дополнение к исследованиям клеточной культуры, мы использовали этот метод для изучения патогенности экзосомно-производных тау.
