Это сообщение, которое может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как обогатить и определить нитропептиды с помощью химического подхода и масс-спектрометрии. Этот метод имеет повышенную чувствительность для обнаружения нитропептидов с помощью масс-спектрометрии и который может быть применен как к биохимическим системам in vitro, так и к эндогенным биологическим тканям. Для десалирования нитро-ангиотензина II используйте одноми миллилитрную трубу для предварительного извлечения твердой фазы обратной фазы или столбца SPE с добавлением 500 микролитров метанола и 500 микролитров воды в верхнюю часть колонны.
Когда вся вода проехает через колонну, загрузите на колонну 410 микролитров раствора нитроангиотензина II. Вымойте колонку с 500 микролитров 5%метанола и воды и 300 микролитров 80% метанола и воды, чтобы утоить нитропептида. Затем высушите элуат по скорости вакуума в настройке по умолчанию при комнатной температуре.
Для первичной алкиляции амина, восстановить порошкообразный нитро-ангиотензин II в 100 микролитров 100 миллимолярный триэтиламмоний бикарбонатный раствор и добавить 400 микролитров 4%формальдегида к раствору в дым капот с кратким смешивания. Затем добавьте четыре микролитера 0,6 молярного цыаноборогидрида к раствору при встряхивании при 400 вращениях в минуту в течение одного часа при комнатной температуре. В конце инкубации утоляют реакцию маркировки 16 микролитров 1%аммиачного раствора в течение пяти минут при комнатной температуре с последующим подкислением с восемью микролитерами кремной кислоты.
Затем опреснюете решение в новой колонке SPE обратной фазы, как это было продемонстрировано. Для сокращения нитротирозина до аминотирозина, воссоздайте диметил-маркированную нитроангиотензин II в 500 микролитров PBS и добавьте 10 микролитров одного дитионата натрия в течение одного часа инкубации при комнатной температуре. После снижения реакции, желтый раствор станет ясно.
Опустить уменьшенную выборку в новой колонке SPE обратной фазы, как это было продемонстрировано. Для биотинилирования и обогащения, восстановить диметил-маркированных аминоангиотензина II в 500 микролитров PBS следуют добавление пяти микролитров 40 наномолярных NHS-S-S биотин растворяется в диметил сульфоксид в течение двух часов инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации, утолить реакцию с одним микролитером 5%гидроксиламина и добавить 500 микролитров свежего PBS до 100 микролитров Streptavidin Agarose бусы для эквилибрации тремя отдельными центрифугами.
После последней центрифугации добавьте 100 микролитров бисера в систему реакции в течение одного часа инкубации на Ротари Шейкер при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть систему четыре раза с 500 микролитров свежего PBS за стирку с последующим добавлением 400 микролитров 10 миллимолярный дитиотрейтол в течение 45 минут инкубации при 50 градусов по Цельсию. В конце инкубации, спина вниз по колонке и передачи супернатанта в новую трубку, содержащую 20 микролитров 0,5 молярного иодоацетамида в течение 20 минут инкубации в темноте.
Затем опреснють раствор в новой обратной фазе SPE колонки, как попродемонстрировано и решить сухой пептид в 20 микролитров 0,1% formic кислоты. Для обнаружения загрузите продукт на жидкий хроматограф с тандемным масс-спектрометром. Разделите модифицированные пептиды ангиотензина II на 60-минутный градиентный элюзион со скоростью потока 0,3 микролитера в минуту с системой жидкой хроматографии высокого давления, которая непосредственно взаимодействует с масс-спектрометром высокого разрешения.
В режиме получения данных, зависящих от данных, установите единый полный спектр массы сканирования в масс-спектрометре, а затем 20 зависящих от данных тандемных масс-спектрометров сканируют на 28% нормализованной энергии столкновения. Затем откройте данные о массовых спектрах и определите пики продукта на каждом шагу, чтобы подтвердить, что химическая реакция была успешно выполнена. Здесь можно наблюдать репрезентативные массовые спектры ангиотензина II до и после каждой химической модификации, как это было продемонстрировано.
Молекулярный вес соединения указывается значениями соотношения массы к заряду моноизотопного пика, что указывает на то, что химическая модификация ангиотензина II была успешно достигнута для этого шага. Здесь показан конечный продукт, который обнаруживается и характеризуется жидкой хроматографией с тандемной масс-спектрометрией. Количественный анализ нитропептидов с помощью диметил-маркировки позволяет вычислить относительное количество света и тяжелых путем сравнения интенсивности моноизотопного пика в каждой группе, что позволяет количественно оценить обогащенные нитопептиды из разных групп.
Следуя процедуре, вы можете использовать поисковую систему программы, такую как максимальный отсчет ФСИН, чтобы определить потенциальные нитропептиды. После своего развития, эта техника проложила путь для начала биологических функций конкретных нитратных участков.
