Представленный протокол облегчит исследования по транс и много поколений эффекты белков, которые могут существовать в течение длительного времени в окружающей среде. Мы использовали свободно живущих нематод с 99,5 в качестве гермафродитов, чтобы сэкономить время и усилия в изучении транс и нескольких поколений эффектов. Этот метод может быть использован для демонстрации долгосрочных последствий конечных препаратов, потому что нематод в настоящем протоколе разделяет многие консервативные механизмы или пути с людьми.
Этот метод может дать представление о таких областях, как фармацевтический синтез и управление окружающей средой, поскольку они нуждаются в обратной связи с потенциальными опасностями химических веществ. Этот метод может быть применен к Daphnia magna с большим акцентом на водную токсичность. Также Drosphila melanogaster для дальнейшего изучения влияния на пол.
Он или она будет застрял с идеей, что изучение эффектов на протяжении поколений является время и энергоемкие. Не пугайтесь при первом впечатлении. Следовать протоколу даст вам плодотворный результат.
Для культуры E.coli, пипетка 200 микролитров из бактериальных суспензий в 50 миллилитров LB среды в колбе. Или используйте инокуляции петли, чтобы выбрать небольшую колонию из NGM агары и поместить его в среде LB. Для культуры C.elegans, под микроскопом, подсчитайте нематод на укладке NGM агары подготовлены ранее.
Когда число достигает около 2000, используйте стерильный наконечник, чтобы сократить 1/6 от агара NGM и передать его на недавно подготовленные агары NGM с бактериальной лужайкой. Держите NGM агары с ног на голову в 22 градусов по Цельсию инкубатор для последующей культуры. Примерно через 36 часов нематоды становятся гравидами.
Используйте два миллилитров стерильной воды, чтобы смыть гравидные нематоды и недавно произведенные яйца на каждом NGM-агаре в стерильные центрифуги. Поместите трубки на стойку в течение 30 минут, чтобы успокоить нематод, а затем отбросить 85% супернатантов путем трубопроводов. Очень важно судить, достаточно ли нематод для синхронизации.
В противном случае операция по синхронизации возраста была бы напрасной. Смешайте гранулы с семью томами раствора гипохлорита натрия и встряхните центрифуговые трубки каждые две минуты в течение пяти-восьми раз, чтобы вынизать личинки и взрослые нематоды. Центрифуга труб при 700 раз G в течение трех минут при 20 градусах по Цельсию, а затем отказаться от supernatants путем трубопроводов.
Повторно приостанавливайте гранулы в пяти томах стерильной воды для мытья возрастных синхронизированных яиц. Центрифуга при 700 градусах G в течение трех минут при 20 градусах цельсия. Повторите мыть стерильной водой, в два раза.
Затем добавьте один объем стерильной воды в трубки, чтобы повторно приостановить возраст синхронизированные яйца. Распространение яичных суспензий путем пипетки пятьдесят микролитров на каждый новый NGM агары с бактериальным газоном. Держите NGM агары верхней стороне в 20 градусов по Цельсию инкубатор в течение 30 минут, что позволяет воде испаряться или быть поглощены бактериальной лужайке.
Затем переключить NGM агары, вверх дном, для последующей культуры, и отметить время, как яйцо времени. Через 36 часов после яйцеклетки нематоды достигают стадии личинок L3. Используйте два миллилитров стерильной воды, чтобы смыть нематод с каждого NGM агара в центрифуги труб.
После урегулирования в течение 30 минут, заменить 85% супернатантов с K Средний переварить пищу в кишечнике в течение двух часов. Затем отбросьте супернатанты. Используйте K Medium для регулировки подвески нематод примерно до 200 нематод на 100 микролитров для последующих экспериментов.
Чтобы избежать краевых эффектов, в средней области 96-хорошо стерильной микроплюхи, добавьте 100 микролитров подготовленных контрольных или химических растворов в 10 скважин, как реплицирует в шести группах. Добавьте 100 микролитров подготовленного нематод K Medium к каждой из 60 скважин. Отметь время как T0. Выполните экспозицию в течение 24 до 96 часов.
После экспозиции используйте пипетку для сбора нематод из пяти скважин в каждой группе, в шесть 1,5 миллилитровых центрифуг труб. Уладить нематод в течение 30 минут, а затем пипетки, чтобы отказаться от supernatants. Вымойте нематод на дне одним миллилитром стерилизованной воды.
Посели нематод в течение 30 минут. Откажитесь от супернатантов и используйте нематод внизу для измерения индикаторов генерации открытых родителей, помеченных как F0. Соберите нематод из оставшихся пяти скважин в каждой группе. Поселить и вымыть нематод, как и раньше.
Затем добавьте 100 микролитров стерильной воды, чтобы повторно приостановить нематод в каждой трубке, и равномерно перенесите подвески нематод на три недавно подготовленных агара NGM с бактериальным газоном. Инкубировать нематод в течение 36 часов, чтобы стать gravid, и выполнять возраст синхронизации, как и раньше. После инкубации синхронизированных яиц на ngM агарах с бактериальным газоном в течение 36 часов, промыть нематод в шесть трубок центрифуги.
После заселения и мытья одним миллилитром стерилизованной воды используйте нематоды внизу для измерения показателей поколения потомства, отмеченного как T1. Смешайте 99 миллилитров теплых агар NGM с одним миллилитром контрольных или химических растворов. После подготовки агары с бактериями подвески в соответствии с рукописью, в био-безопасности кабинета, отложите верхние крышки чашки Петри и подвергать бактериальный газон УФ-излучения в течение 15 минут. Pipette возраст-синхронизированные яичка на UV-обработанные agars.
Отметь начало воздействия родительского поколения, F0, как нулевой день. Инкубировать агары в течение трех дней при 20 градусах по Цельсию. Затем используйте зрелые нематоды для измерения эффектов в F0. Кроме того, на третий день используйте стеклянный стержень, оснащенный проволокой из человека, согнутой в кольцо, чтобы выбрать зрелые нематоды F0, и скользить по поверхности новых УФ-обработанных агаров NGM.
На четвертый день, выбрать и отказаться от зрелых нематод F0 от NGM агаров. На шестой день используйте зрелые нематоды F1, которые испытывали воздействие в течение трех дней для измерения индексов. В этом протоколе, транс-поколения эффекты кадмия, меди, свинца и цинка на тело изгиб частоты показали, что ингибиции в нематод родителей, F0, после пренатального воздействия были меньше, чем в их потомство, T1. Многопоколенческие остаточные эффекты сульфаметоксазола на продолжительность жизни и размножение нематод показали, что размножение было значительно затронуто воздействием зародышевой линии, а токсичность сохранялась в не подвергающихся воздействию поколениях от Т3 до Т6 поколений.
Воздействие на несколько поколений и остаточное воздействие линдана на биохимические и генетические показатели нематод показали обезогенное воздействие с нарушениями регуляции сигнала инсулина. Кроме того, изменения между sgk-1 и akt-1 сигнализации показали, что нематод из разных поколений воздействия показали различные стратегии реагирования на толерантность и избегание. Проверьте состояние жизни нематод перед каждой операцией и измените следующие шаги соответствующим образом.
Другие эффекты, например, обезогенное воздействие химических веществ, могут быть включены для дальнейшего ответа на растущую распространенность ожирения на протяжении поколений. На основе метода можно изучить дальнейшие механизмы. Например, назойляемые эпигенетические сигналы между поколениями.
Растворы хлора имеют сильные оксидативные потенциалы и избегают прямого контакта кожи с ней.
