Рецепторы P2X7 чрезвычайно универсальны и функционируют по-разному в зависимости от количества агониста настоящее время. Таким образом, P2X7 имеет различные функции и может регулировать физиологию многих различных систем. Этот протокол позволяет изутовить три основные функции рецептора P2X7.
Это быстрый, воспроизводимый и поддающийся количественной оценке метод для понимания его функции. Наше внимание в том, как P2X7 рецепторы могут модулировать в нейронных клеток-предшественников. Однако этот метод может быть легко адаптирован в соответствии с любым типом клеток.
Студенты, которые прочитали достаточно литературы, прежде чем пытаться эту процедуру можно узнать, что всего за один день и быть в состоянии запустить все это в одиночку после двух или трех попыток. Начните эту процедуру с получения нейронных клеток-предшественников из субвентрикулярной зоны и гиппокампа взрослых мышей, как описано в текстовом протоколе. Поддержание культур на 37 градусов по Цельсию с 5%carbon dioxide.
Нейросферы должны образовываться через 7-10 дней, это прохождение нулевой культуры субвентрикулярной зоны и через 15-20 дней в гиппокампе культуры. После первоначального прохождения нулевой фазы культуры, прохождение каждые семь-десять дней по мере необходимости с использованием биологического шкафа безопасности и стандартных методов культуры тканей. Прохождение сфер, когда они достигают от 150 до 200 микрон в диаметре.
Соберите сферы и среды в 15 миллилитров трубки и спина на низкой скорости в течение двух минут. Удалите среду и инкубировать клетки с реагентом диссоциации в течение семи до 10 минут при 37 градусах по Цельсию в зависимости от размера сфер. Наконец, подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика ячейки.
Мы приостанавливаем одиночные клетки в одном миллилитре без кальция натрия среды. Затем загрузите клетки двумя ниниграммами на миллилитр красителя кальция и 10 микролитров 5%плуроновой кислоты. Инкубировать клетки в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию.
Вымойте клетки, добавив три-пять миллилитров без кальция натрия среднего и мягко центрифугирования. Удалить супернатант и вновь приостановить клетки в без кальция натрия среды, мыть во второй раз. Повторно приостанавливать клетки в один миллилитр без кальция натрия среды.
Затем поместите клетки на лед и дайте им де-эстерифицировать в течение 30 минут. Вымойте клетки еще раз, добавив три-пять миллилитров калия среды и центрифугирования, как раньше. После повторной приостановки клеток в среде калия, eliquate их в флуоресценции активированных клеток сортировки или FACS труб при концентрации одного миллиона клеток на 500 микролитров на facS трубки.
Поместите трубки FACS на лед до тех пор, пока клетки не будут готовы к анализу. Не оставляйте клетки на льду в течение длительного периода, но начать анализ как можно скорее. Для некоторых образцов, предварительно инкубировать клетки с P2X7 рецепторов конкретных ингибитор, как описано в текстовом протоколе.
За несколько минут до запуска первого образца добавьте хлорид кальция в окончательную концентрацию одного миллимолара и поместите трубку в водяную ванну 37 градусов по Цельсию, чтобы восстановиться. Брось чистый небольшой магнитный мешалка в трубку FACS и распоить трубку в модуле времени, который связан с циркулирующей 37 градусов по Цельсию водяной бане для контроля температуры образца. Выберите низкую скорость перемешивания, чтобы обеспечить движение образца без введения эффекта вихря.
Поместите кувшин с водой и адаптер трубки на платформу образца и закройте рычаг рычага машины FACS. Инициировать приобретение образца и запустить образец в течение трех минут около 1000 событий в секунду. На 40-секундной отметке быстро удалите трубку и добавьте агонист P2X7.
Либо один миллимолярновый АТФ, либо 300 микромолейных BzATP. Затем замените трубку, чтобы продолжить приобретение. Пока записывается первый образец, подготовь второй образец с хлоридом кальция.
Поместите его в 37 градусов по Цельсию, чтобы достаточно времени для клеток, чтобы согреться до анализа. Как только первый образец закончился, очистить потребление, запуская образец воды. Тогда приобретение второго образца может начаться, как и раньше.
Всегда очищать потребление между образцами. Создайте одноклеточную подвеску, как и прежде, и сохраните несколько миллилитров кондиционированной среды. Используйте среду, чтобы повторно приостановить клетки с концентрацией в один миллион клеток на 100 микролитров на трубку FACS и поместить клетки на лед до готовности.
Перед запуском анализа добавьте 900 микролитров калийной среды для конечного объема в один миллилитр. Поместите трубки в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 10 минут, чтобы восстановиться. Если это применимо, предварительно инкубировать клетки с лечения, включая P2X7-специфических ингибиторов.
Непосредственно перед запуском анализа добавьте в трубку FACS 25 микромоляных бромистого этидия. Затем добавьте магнитный мешалку, поместите трубку на машину FACS и начните приобретение, как и раньше. Чтобы вызвать образование пор в клеточной мембране, добавьте один миллимолярновый АТФ или 100 микромолейных BzATP через 40 секунд после начала приобретения.
Вы запустите образцы на уровне около 1000 событий в секунду в течение шести минут. В то время как первый образец работает, возьмите второй образец со льда и поместите его в 37 градусов по Цельсию водяной бане, чтобы достаточно времени для клеток, чтобы восстановить до анализа. После того, как первый образец приобретения закончился и потребление было очищено, второй образец может быть помещен на машине, чтобы начать запись.
Мы приостанавливаем одиночные клетки в кондиционированной среде и eliquate их в facS труб при концентрации по крайней мере один миллион клеток на 100 микролитров на facS трубки. Разбавить клетки до конечной концентрации одного миллиона клеток на миллилитр со средой натрия и поместить клетки на лед до тех пор, пока анализ не будет выполнен. Используйте один микрон широкий G-бисер в качестве фагоцитических целей для анализа фагоцитоза в режиме реального времени.
Перед запуском первого образца, передать клетки на 37 градусов по Цельсию водяной бани и инкубировать их в течение примерно семи до 10 минут, чтобы клетки для восстановления. Добавьте любые процедуры, требующие предварительной инкубации к их соответствующим трубам, включая АТФ, окисленные АТФ, цитокелин D и 4%paraformaldehyde. Предварительная инкубация не требуется для сыворотки 5%человек.
Если лечение добавляется примерно в то же время, образцы могут быть запущены последовательно, а другие продолжают инкубировать, потому что их инкубации различаются. Поместите образец на цитометр с магнитным мешалки и инициировать приобретение образца, как и раньше. Удалите образец трубки из машины через 15-20 секунд после начала приобретения и добавьте пять микролитров неразбавленных бусинок YG.
Верните образец трубки FACS на прибор и продолжайте приобретение. Вы запустите образцы в течение семи-восьми минут со 1000 событий в секунду. В то время как первый образец работает, возьмите второй образец из льда и поместите его в 37 градусов по Цельсию водяной бане, чтобы достаточно времени для клеток, чтобы восстановить до анализа.
После того, как первый образец в законченном и потребление было очищено, начать приобретение на второй образец. При построении с течением времени, приток кальция, как правило, аналогичны в гиппокампе и субвентрикулярной зоне нейронных клеток-предшественников. Агонисты были добавлены на 42-й отметке.
BzATP быстро активирует рецепторы P2X7, открывая ионный канал и позволяя приток кальция, который связывается с флуо-8 и флуоресц. Применение АТФ обычно приводит к более постепенному притоку кальция. Он имеет более низкое сродство к P2X7 по сравнению с BzATP, а также приведет к активации G-белка в сочетании рецепторов.
После применения АТФ агониста и BzATP, цитометрия потока времени захватывает бромид этидия, попадающих в клетки через трансмембранные поры в режиме реального времени. Этот эффект был окучен ингибитором P2X7. Анализ реакции концентрации АТФ иллюстрирует влияние агонистической концентрации на образование пор P2X7 с использованием изменения флуоресценции бромистого этидия с течением времени.
Здесь P2X7 рецепторов участие фагоцитоз гиппокампа и субвентрикулярной зоны нейронных клеток-предшественников показывается в режиме реального времени. Расковано фагоцитоз уровни YG латексные бусы были установлены в качестве положительного контроля. АТФ ингибирует фагоцитоз бисера YG в той же степени, что и неспецифические ингибиторы, а именно параформальдегидную фиксацию и ингибитор актин полимеризации цитокелисина D.5%serum отменил все врожденные фагоцитозы.
Поддержание здоровой популяции клеток и сокращение времени на льду имеет жизненно важное значение для получения воспроизводимых результатов. Вариативность может быть сведена к минимуму с помощью одной и той же партии АТФ для анализа всей ячейки. Наш приумный результат цитометрии потока, продемонстрирован здесь, является единственным сообщением, которое может продолжать выбирать количество потоков и изменений в целевой субнаселения.
Альтернативным методом является флуоресцентный микроскоп и флуоресцентный считыватель блюд. Тем не менее, этот метод не может непрерывно измерять флуоресцентные изменения из-за флуоресцентной программы сродства. P2X7 является уникальным мультимодальным.
Открытие его выражения на ячейке интересов открыть ряд уникальных вопросов для исследователей, чтобы исследовать.
