Рост числа недавних эпидемий, таких, как вирус Зика и Вирус Эбола, подчеркнул необходимость более скоординированных и гибких ответных мер в глобальном масштабе. Для достижения этой цели мы разработали инновационное, масштабируемое внутримодное лабораторное подразделение, которое будет использоваться в районах с ограниченными ресурсами во всем мире во время таких вспышек. Здесь мы представляем наши внутримодальные, расширяемые, мобильные контейнерные лаборатории.
И в следующем документе мы представляем наш подход BSL-2 и BSL-3 к диагностике вируса респираторного гриппа. Быстрая диагностика вируса гриппа с помощью RCT-PCR. Прежде чем готовиться к входу в установленный лабораторный блок, имейте в виду, что все требования безопасности BSL-2 должны быть учтены.
Это включает в себя одевание с надлежащим защитным оборудованием, мытье рук, ношение перчаток, и обеззараживание любых рабочих пространств вы планируете использовать. Обратите внимание, что если вы используете отбеливатель для обеззараживания рабочего пространства и принадлежностей, вы также должны использовать 70% этанола для очистки всех областей, подверженных отбеливателю, как отбеливатель может смешиваться с другими химическими веществами в рабочем пространстве для создания токсичных паров. Утилизировать все продукты отбеливателя в свои собственные назначенные мусорные баки.
Поскольку пробы мазков взяты у пациентов, они транспортируются в лабораторное учреждение с места или клиники и передаются лаборанту через сквозное окно. Это окно не может быть открыто с обеих сторон. В сквозном окне BSL-2 внешняя поверхность трубок, содержащих образцы, должна быть полностью дезинфицирована отбеливателем и оставлена в покое, чтобы сидеть в течение двух минут.
Откройте сквозное окно и соберите образцы для регистрации. Протрите любые образцы, которые имеют остатки отбеливателя, и протрите вниз интерьер сквозного окна с отбеливателем, а затем 70%этанола раствора. Добавьте штрих-коды к каждой пробной трубке и четырем пустым трубкам, предназначенным для алицитов.
Переместите образцы в вентиляционный капот. Сканирование штрих-кода на каждой трубке и убедитесь, что правильная идентификационная информация образца появляется на планшетной системе или экране ноутбука. Завершите процесс регистрации.
Пример алицита. После того, как пробирки были помечены, используйте сертифицированный и обеззараженный шкаф биобезопасности ii класса, чтобы взять алициты образцов. При приеме aliquots обязательно используйте свежие стерильные или одноразовые пипетки для каждого образца и выбросить их в биоопасные контейнеры отходов, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
Убедитесь, что каждая трубка плотно запечатана и закрыта. Используйте одну алицит на образец для немедленной экстракции. Храните любые другие aliquots в морозильной камере для использования в будущем.
Перед переходом на рабочую станцию очистите все рабочие поверхности и оборудование отбеливателем, за которым последует 70%этаноловый раствор. После того, как ваши штрих-коды ПЦР образцы были aliquoted переместить их на рабочую станцию, предназначенную для извлечения. Подготовь буферную смесь РНК-носителя AVL для шага лиза.
Образец и лиза буфер мастер смесь должна храниться при комнатной температуре. Наклеить этикетку на 1,5-миллилитровую центрифугу. Установите наконечник пипетки до 560 микролитров.
Нанесите чистый наконечник пипетки. Добавьте буфер лиза к каждой трубке. Отбросьте наконечник в контейнере для отходов.
Затем возьмите образец PCR aliquot. Поместите его в подготовленную буферную трубку лиза, предназначенную для aliquot one, и повторите это для любых дополнительных образцов. Откажитесь от старого наконечника пипетки и нанесите чистый наконечник пипетки.
Нанесите чистый наконечник пипетки. Добавьте 140 микролитров буфера в контрольную трубку. Закройте каждую трубку надежно.
Пульс-вихрь в течение 15 секунд. Повторите с любыми дополнительными aliquots или образцы. Микроцентрифуг каждого образца в течение пяти секунд.
Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут. Через 10 минут кратко центрифуга труб, чтобы удалить любые капли изнутри крышки каждой трубки. Добавьте 560 микролитров этанола в образец один.
Измените кончик пипетки. Повторите с любыми оставшимися или дополнительными образцами. Закройте каждый образец трубки надежно.
Пульс-вихрь каждого образца в течение 15 секунд. Микроцентрифуг образцов в течение пяти секунд. Получить чистую двухми миллилитровую трубку сбора.
Добавьте столбцы спина. Наклейте на них этикетку, чтобы соответствовать вашим образцам. Передача 630 микролитров образца, чтобы соответствовать столбец соответственно.
Защищите свои кепки. Двигайтесь к центрифуге. Равномерно распределите образцы в центрифуге.
Центрифуга на 6000 г в течение одной минуты, чтобы удалить буфер лиза. Возвращение к рабочей станции. Замените трубки коллекции.
Добавьте оставшийся буфер лиза и повторите шаг центрифугации. Откажитесь от исходных пробных трубок aliquot, после чего утилизировать элуат и промыть спиновую колонку буфером AW1. Повторите эту процедуру с каждым образцом или любыми дополнительными образцами.
Закрепте колпачки на каждом образце и центрифуге на шесть г. Повторите со вторым буфером мытья AW2 на 20 г. Наконец, поместите колонку в чистую 1,5-миллилитровую трубку.
Откройте колонку и добавьте 60 микролитров буфера AVE. Инкубировать при комнатной температуре в течение одной минуты и центрифугу на шесть г в течение одной минуты. Образец готов к анализу ПЦР.
В условиях BSL-3 экспериментальный протокол останется прежним, но меры безопасности будут иметь прецедент превыше всего. Перед входом в лабораторию BSL-3 посмотрите через прозрачное окно, чтобы убедиться, что отрицательное давление было установлено в блоке перчаточного ящика. Будет видно, что отрицательное давление было установлено, когда мяч в стене виден.
После того, как отрицательное давление было установлено открыть дверь и войти в блок. Немедленно вымойте руки, а затем перейти к вашей PPE контрольный список. Приступайте к надеванию СИЗ в следующем порядке: под перчатки, халат, бахилы, маска, щит для лица, вторая пара перчаток.
Включите машину и позвольте давлению в бардачке стабилизироваться. Используйте раствор отбеливателя спрей для обеззараживания всех областях и поставок вы планируете использовать внутри и за пределами перчаточного ящика. Утилизация любых отбеливатель отходов в отбеливатель только контейнер.
Используйте 70%ethanol раствор для очистки над любыми областями, где отбеливатель был использован. Перенесите свои образцы через сквозное окно. Образцы должны были быть распылены с раствором отбеливателя и оставили в покое, по крайней мере одну минуту в сквозной перед получением их внутри блока BSL-3.
Затем получите образцы внутри блока BSL-3 и тщательно очистите их, прежде чем перейти к этапу регистрации и маркировки. После того, как образцы зарегистрированы и трубки были помечены, поместите образцы в перчаточный ящик через поднос шлюза. Не открой обе двери сразу.
Откройте и закройте каждую дверь в два разных шага в целях предосторожности. После того, как образцы были безопасно перемещены в салон перчаточного ящика, следуйте тем же шагам, что и ранее описанные для создания образцы aliquots в перчаточном ящике. После того, как образцы aliquoted переместить образцы в герметичный контейнер.
Спрей отбеливатель раствор в перчаточном ящике для обеззараживания труб и всех других поверхностей. Подождите пять минут, а затем применить 70%этанол раствор для мытья отбеливателя. После тщательного обеззараживания перемещаются только образцы, необходимые для анализа ПЦР для лиза, шаг назад в перчаточный ящик.
В перчаточном ящике выполняют только этап лиза процедуры экстракции. После того, как клетки были lysed, плотно печать шапки на каждом образце и поместить их в под давлением шлюз проход. Обеззараживать перчаточный ящик снова с отбеливателем следуют 70%этанола раствора.
Перемести образцы из перчаточного ящика и перенесите их на рабочую станцию для остальных этапов процедуры извлечения. После извлечения перенесите образцы в сквозное окно для анализа ПЦР. После того, как образцы были удалены и переданы, обеззараживать лабораторное рабочее пространство за пределами перчаточного ящика.
Прежде чем удалить СИЗ, подождите, пока циркуляция воздуха в блоке благополучно достигла надлежащего количества циклов фильтрации, прежде чем начать удалять PPE. Сразу же после удаления и утилизации всех СИЗ в контейнер для отходов СИЗ, приступить к мытью рук в лаборатории раковина с мылом и водой перед выходом из блока. Усиление и обнаружение ПЦР.
Удалите извлеченные образцы РНК из сквозного окна. Подготовь мастер-микс в 1,5-миллилитровой трубке со следующими компонентами для каждого целевого анализа: вода, грунтовки и зонды, атакующей смеси и 2X буфера. Vortex и спина мастер-микс, после чего, aliquot мастер смесь в каждой из трубок полосы.
Верните комплект ПЦР на хранение при рекомендуемых температурах после того, как мастер-микс будет подготовлен. Добавьте образцы к каждой из трубок прокладки используя отдельный подсказку между каждой пробкой прокладки. Спин образцов на 1500 об / мин в течение одной минуты, после чего образцы готовы быть загружены на блок ПЦР в режиме реального времени.
После загрузки образцов на ПЦР-инструмент требуется около 90 минут, чтобы завершить один запуск. Анализ ПЦР в режиме реального времени является чувствительным методом надежного обнаружения вируса. Это можно увидеть в таблице с пометкой:PCR Проанализированные результаты.
Перед тем, как собрать результаты и покинуть лабораторию, удалите СИЗ и адекватно обеззараживаете каждую рабочую станцию в рамках подготовки к следующему диагностическому тесту. Результаты представительов. Лабораторный рабочий процесс представлен на диаграмме, которая подчеркивает личную защиту.
Экспресс-диагностический тест на грипп проводится с помощью анализа RT-PCR. Процедура состоит из четырех основных этапов, и для каждого этапа протокола назначаются отдельные рабочие области. Целью этого проекта является проверка нового модульного оперативно развертываемого лабораторного объекта, и мы успешно это сделали, а также разработка учебных программ для лабораторного персонала, работающего в условиях ограниченных ресурсов во время эпидемий и вспышек.
