Этот метод позволяет изучить основной механизм миелинизации и ремиелинизации на клеточном и тискулярном уровне. Этот метод находится на перекрестке между основными культурами и подходами in vivo. Это быстрая и доступная модель с основным преимуществом сохранения архитектуры тканей.
Демонстрация процедуры будет Мелина Thetiot, постдокторант исследователь и Реми Ronzano, аспирант из моей лаборатории. Для начала вставьте маленькие ножницы осторожно в foramen magnum и вырезать череп, сделав один боковой разрез в сторону, а затем вырезать все вокруг черепа головы. Для извлечения спинной части черепа используйте тонкие прямые типсы, чтобы аккуратно поднять спинную часть черепа.
Затем осторожно ввести миппы между брюшной череп и мозг. Аккуратно переверните мозг и вырежьте зрительные и тригеминальные нервы маленькими ножницами. Затем поверните голову или спинную часть черепа вверх дном чуть выше 60-миллиметровой клеточной культуры блюдо, содержащее ледяное вскрытие среды, чтобы помочь мозгу упасть под действием силы тяжести.
Используя тонкие миппы, сориентировать мозг с спинной стороны лицом вверх и брюшной стороны лежа. Под бинокулярным микроскопом используйте тонкие прямые типсы для обездвиживания мозга на стороне forebrain. Затем отделите задний мозг от остальной части мозга.
Вырезать мозжечковые педункулы под мозжечок, чтобы отделить мозжечок от остальной части заднего мозга. После того, как мозжечок изолирован, используйте тонкие, прямые миппы, чтобы тщательно оторвать око. Держите мозжечок осторожно с тонкой, изогнутые типсы и поместите его с спинной стороной вверх на пластиковую платформу, перпендикулярно измельчитель лезвие бритвы.
Далее, с стерильным, тонким кончиком пипетки конца прилагается к одноми миллилитров пипетки, аспирировать любой доступ вскрытия среды вокруг мозжечка. Затем, с помощью вертолета ткани, нарежьте 300 микрометров толщиной сагитальных секций мозжечка. Затем аккуратно добавьте каплю среды вскрытия на нарезанный мозжечок.
Затем, с широким кончиком пипетки кабана прилагается к одной миллилитр пипетки, медленно аспирировать нарезанный мозжечок и передать его обратно в 60 миллиметров клеточной культуры блюдо, содержащее ледяной вскрытия среды. Затем используйте два тонких прямых типса для отдельных ломтиков. Затем, с широким кончиком пипетки кабана, прикрепленным к одноми миллилитровой пипетке, перенесите до четырех выбранных ломтиков из вермы, а также некоторые средства вскрытия на одну культурную вставку из шести хорошо пластины.
Удалите любой доступ к среде вскрытия вокруг ломтиков, используя тонкий кончик пипетки конца. Для демиелинизации удалите всю культурную среду ниже культуры, вставьте через шесть дней в пробирке, и замените ее на один миллилитр на колодец предварительно разогретой свежей культуры среды, содержащей 0,5 миллиграмма на миллилитр LPC. Инкубировать в течение 15 до 17 часов при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа окружающей среды.
После инкубации, мыть вставки, поместив их в 25 миллилитров Петри блюдо, содержащее один миллилитр предварительно разогретой среды культуры. Затем немедленно перенесите культурные вставки в новую, шесть хорошо пластин, содержащих свежие, предварительно разогретые среды культуры. Чтобы начать иммуногистохимию, сначала используйте forceы, чтобы поднять культурные вставки и удалить культурную среду под ними.
Затем добавьте два миллилитров 4%PFA в 1x PBS, ph 7.4, на мембранные вставки, чтобы исправить мозжечковые ломтики. Через 30 минут, мыть ломтики три раза с двумя миллилитров 1x PBS в течение 10 минут каждый мыть. Затем, под бинокулярным микроскопом, используя увеличение от 25x до 30x, используйте скальпель или кисть, чтобы аккуратно отделить ломтики от мембранных вставок.
Затем используйте кисть для передачи плавающих ломтиков в колодцы четырех скважин пластины, содержащей 1x PBS, чтобы ограничить потребление антител. Затем, аспирировать PBS из каждой хорошо и инкубировать ломтики в предварительно охлажденных 100% этанола при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение 15 до 20 минут. После инкубации, аспирировать 100% этанола и мыть ломтики кратко с 1x PBS.
Затем мыть их два раза при комнатной температуре с 1x PBS в течение 10 минут каждый мыть. Чтобы блокировать неспецифические сайты фиксации антител, аспирировать PBS и инкубировать ломтики в растворе, содержащем 1x PBS, 5%NGS, и 0.3%non ионные моющие средства при комнатной температуре в течение 30 до 45 минут. Затем добавьте первичные антитела, разбавленные блокирующим раствором, и инкубировать ломтики при четырех градусах Цельсия за одну ночь.
После ночной инкубации, мыть ломтики три раза с 1x PBS в течение 10 минут каждый мыть. Затем добавьте вторичные антитела, разбавленные блокирующим раствором, при соотношении разбавления от одного до 500 и инкубировать ломтики при комнатной температуре в темноте в течение трех часов. После инкубации со вторичным антителом, мыть ломтики три раза в 1x PBS в темноте в течение 10 минут каждый мыть.
Затем, под бинокулярным микроскопом, поместите 100 микролетеров 1x PBS на слайд и кистью, перенесите ломтики в PBS и сгладите их на слайде. Удалите любой доступ PBS. Наконец, поместите каплю монтажной среды прямо на стеклянную крышку скольжения и аккуратно покрыть ломтиками.
Миелин иммуностимуляторов в органотипных мозжечковых ломтиков, полученных от пост натальных дней 9 до 10 C57 черный шесть диких мышей типа наблюдались в 11 дней в пробирке с узлами ronviae обогащенных в напряжении закрытых каналов натрия, в окружении паранодального аксонального соединения домена. Те же результаты наблюдались у трансгенных мышей PLP-GFP. Миелинизация паркенги клеток в основном достигается после одной недели в культуре.
LPC лечение полностью демиелинат ломтики, которые ремиелинат спонтанно и полностью миелинов шесть дней после демиелинизации. Эта процедура должна занять максимум 25 минут. Это действительно самый критический момент.
Органотипическая культура ломтика подходит для живого изучения динамики миелинизации. Он также может быть использован для ориентации экспериментов скрининга наркотиков. Этот метод позволяет легко, количественный подход для изучения процессов миелинизации и ремиелинизации.
Экспериментаторы должны следовать основным процедурам безопасности, применяемым к благополучию животных, чрезмерной и резкой миелинизации.
